涉及經工程改造的CD16的多肽、細胞和方法與流程

本申請要求于2014年3月28日提交的美國臨時專利申請序列號61/971,996的優先權，所述申請通過引用結合到本文中。發明概述本公開內容一般地描述修飾形式的CD16，表達修飾的CD16的遺傳修飾的細胞，和涉及遺傳修飾的細胞的方法。所述修飾形式的CD16可顯示增加的抗腫瘤和/或抗病毒活性，這至少部分上是由于減少的對NK細胞刺激時金屬蛋白酶介導的脫落的敏感性。因此，在一個方面，本公開內容描述經遺傳修飾以表達具有膜近側區和膜近側區中的氨基酸修飾的CD16多肽的細胞。在另一個方面，本公開內容描述包含編碼具有膜近側區和膜近側區中的氨基酸修飾的CD16多肽的多核苷酸的細胞。在任何一個方面，所述氨基酸藥物（medication）反映與CD16膜近側區野生型氨基酸序列相比一個或多個氨基酸的添加、一個或多個氨基酸的缺失，或一個或多個氨基酸的置換。在這些實施方案的一些中，一個或多個氨基酸的置換包括SEQIDNO:1的197位的絲氨酸殘疾的置換。在任何一個方面，細胞可為自然殺傷(NK)細胞、中性粒細胞、單核細胞或T細胞。在任何一個方面，與野生型CD16多肽相比修飾的CD16多肽顯示減小的對ADAM17介導的脫落的敏感性。在任何一個方面，與野生型CD1多肽相比修飾的CD16多肽顯示減小的對NK細胞刺激時的切割的敏感性。在另一個方面，本公開內容描述一般地涉及給予需要這種處理的患者包括以下的治療的方法：(a)給予患者治療性NK效應物，和(b)給予患者上文概述的遺傳修飾細胞的任何實施方案。在一些實施方案中，治療性NK效應物包括治療劑。在這些實施方案的一些中，治療劑可包括抗體，或治療性抗體片段。在這些實施方案的一些中，抗體或抗體片段與病毒抗原特異性結合。在其它實施方案中，抗體或抗體片段與腫瘤抗原特異性結合。在一些實施方案中，治療劑可包括雙特異性殺傷銜接體(BiKE)或三特異性殺傷細胞銜接體(TriKE)。在又一個方面，本公開內容描述用于改善對患者的免疫治療的方法，其中所述免疫治療涉及給予患者治療性NK效應物。一般地所述方法包括進一步給予患者上文概述的遺傳修飾細胞的任何實施方案。本發明的以上概述不意在描述本發明的每一公開的實施方案或每一實現。隨后的說明書更具體地例示說明性的實施方案。在整個申請的若干位置，指導通過實施例的列表提供，這些實施例可以以不同的組合使用。在每種情況下，敘述的列表僅用作代表性群組，并且不應解釋為排他的列表。附圖簡述圖1.人CD16中胞外域切割位點的位置。(A)從PMA-活化人NK細胞或中性粒細胞的細胞上清液免疫沉淀的可溶性CD16的胰蛋白酶肽（trypticpeptides）經受質譜分析。鑒定了四個具有非胰蛋白酶C末端的高置信度肽：1個肽來自NK細胞釋放的可溶性CD16(肽#1，左上)，3個肽來自中性粒細胞釋放的可溶性CD16(肽#2，左下；肽#3，右上；和肽#4，右下)。(B)肽#1-4(加下劃線的)以及CD16a(SEQIDNO:1)和CD16b(SEQIDNO:2)中假定切割位點(箭頭)的說明。所鑒定的肽中氨基酸176區分CD16a(F)與CD16b(V)。氨基酸1-16指示CD16a和CD16b的預測信號序列。氨基酸210-229指示CD16a的跨膜區域。氨基酸編號從信號序列中的甲硫氨酸開始。CD16a和CD16b的氨基酸序列分別來自NCBI參考序列NM_000569.6和NM_000570.4。圖2.CD16胞外域脫落、切割區域和經工程改造的絲氨酸-197至脯氨酸突變的示意圖。CD16a和CD16b通過ADAM17在膜近側區內經受胞外域脫落，如所標明的。膜近側區內的CD16切割區域基于質譜分析，其顯示極為貼近的三個不同的切割位點(箭頭)。進行定點突變以將CD16(SEQIDNO:1的氨基酸190-202)中的絲氨酸-197置換為脯氨酸(CD16/S197P)。圖3.經工程改造的S197P突變對CD16a和CD16b脫落的作用。轉染的HEK293(人胚胎腎)細胞以相似水平分別表達CD16b和CD16b/S197P(A)或CD16a和CD16a/S197P(B)，如通過流式細胞術所測定的(左側面板)。用或不用PMA處理(15ng/ml在37℃持續30分鐘)不同轉染子并通過ELISA定量培養基上清液中的CD16的可溶性水平(右側面板)。對于每一實驗，每一處理條件重復三次，數據代表三個獨立實驗。條形圖顯示平均值±SD。統計顯著性表示為***P<0.001。(C)轉染的HEK293細胞表達L-選擇素(CD62L)或L-選擇素和CD16b/S197P。轉染和模擬轉染細胞上L-選擇素和CD16b/S197P的表面水平使用流式細胞術測量(直方圖)。在PMA存在或不存在下37℃孵育表達L-選擇素或L選擇素和CD16b/S197P的轉染子30分鐘，并測定L-選擇素染色的平均熒光強度(MFI)(條形圖)。對于每一實驗，每一處理條件重復三次，數據代表兩個獨立實驗。條形圖顯示平均值±SD。統計顯著性表示為*P<0.05。對于所有直方圖，x-軸=Log10熒光，y-軸=細胞數目。圖4.經工程改造的S197P突變對NK細胞中CD16a脫落的作用。不用(Unstim.)或用PMA(100ng/ml)37℃處理用空載體(僅載體)、CD16a或CD16a/S197P轉導的NK92細胞30分鐘(A)，用IL-12和IL-18(分別100ng/ml和400ng/ml)37℃處理24小時(B)，或用Raji細胞和利妥昔單抗37℃處理60分鐘(C)。CD16a的細胞表面水平通過流式細胞術測定。虛線指示同種型匹配的陰性對照抗體染色。(D)在ADAM17抑制劑BMS566394(5μM)存在或不存在下用Raji細胞和利妥昔單抗37℃處理親本NK92細胞和表達CD16a或CD16a/S197P的轉導細胞60分鐘。可溶性CD16a水平通過ELISA測定。每一處理條件重復三次，數據代表三個獨立實驗。條形圖顯示平均值±SD。統計顯著性表示為***P<0.001。(E)表達CD16a或CD16a/S197P的NK92細胞用抗-ADAM17mAbsM220、623、633或同種型匹配的陰性對照抗體染色，如所標明的。(F)從模擬轉導iPSCs(左側面板)或表達重組CD16a或CD16a/S197P的iPSCs(右側面板)衍生的CD56+CD45+NK細胞與或不與K562靶細胞在37℃孵育4小時。對于所有直方圖，x-軸=Log10熒光，y-軸=細胞數目，并且數據代表至少3個獨立實驗。圖5.經工程改造的S197P突變對CD16a功能的作用。(A)以相等水平表達CD16a或CD16a/S197P的NK92細胞用單體人IgG(0-20μg/ml)處理(左側面板)。作為對照，細胞也用單體人IgA(20μg/ml)處理并用IgG(20μg/ml)處理NK92親本細胞(條)。抗體結合通過流式細胞術測定，如材料與方法中所描述的。條形圖顯示至少三個單獨實驗的平均值±SD。相對于IgG(0μg/ml)、IgA或NK92親本細胞+IgG，統計顯著性表示為*P<0.05。(B)在Raji細胞不存在(Unstim.)或存在下用或不用抗CD20利妥昔單抗37℃孵育模擬轉導的NK92細胞或表達CD16a或CD16a/S197P的NK92細胞達到指定的時間點。NK92細胞活化通過流式細胞術由CD107a染色的上調評估。對于直方圖，x-軸=Log10熒光，y-軸=細胞數目。數據代表至少3個獨立實驗。說明性實施方案的詳述本公開內容一般地描述修飾形式的CD16a，表達修飾的CD16a的遺傳修飾的細胞，和涉及遺傳修飾的細胞的方法。所述修飾形式的CD16a可顯示增加的抗腫瘤和/或抗病毒活性，這至少部分上是由于減少的對NK細胞刺激時金屬蛋白酶介導的脫落的敏感性。與許多實體腫瘤類型相比，在過去的30年間具有上皮性卵巢癌的婦女的存活率幾乎未改變。此外，當前對復發性卵巢癌的標準治療提供低(<20%)響應率。盡管卵巢癌樣品中普遍的HER2過表達，在晚期卵巢癌患者中用抗-HER2抗體曲妥單抗處理僅提供有限的響應。這一對曲妥單抗的抗性可能由功能失調的NK細胞介導的抗體-依賴性細胞毒性引起。因此，存在對創新治療策略的迫切需求。我們描述了一種用于提供治療處理策略的新途徑。卵巢癌的一個關注為周圍環境，其中腫瘤細胞發展可為高度促炎的因此很可能促進浸潤NK細胞上CD16a切割從而減少抗體-依賴性細胞毒性。數種抗體已經作為有效的用于治療人惡性腫瘤的靶向治療而出現。其功效部分上是由于與自然殺傷(NK)細胞上FcγRIIIa/CD16a的抗體相互作用和通過抗體-依賴性細胞毒性誘導殺死癌細胞。人IgGFc受體CD16(FcγRIII)由兩種同種型組成：CD16a(FcγRIIIa)和CD16b(FcγRIIIb)。CD16a由自然殺傷(NK)細胞表達，CD16b由中性粒細胞表達。NK細胞活化通過稱為胞外域脫落(涉及金屬蛋白酶ADAM17和發生在接近質膜的單一胞外區域的蛋白水解事件)的過程導致兩種CD16同種型的表面水平的快速下調(圖1A)。如上文所指出的，卵巢癌患者可能抵抗NK細胞介導的免疫治療——即，腫瘤對NK細胞介導的治療不敏感。例如，卵巢癌細胞通常表達表皮生長因子受體HER2，但用治療抗體曲妥單抗靶向其僅提供有限的臨床響應。該抗性至少部分上可由胞外域脫落造成——即，細胞因子對NK細胞的活化、靶細胞相互作用和/或腫瘤浸潤可導致CD16切割和損傷抗體-依賴性細胞毒性。因此，阻斷胞外域脫落過程具有臨床意義。我們已經使用質譜法測定CD16a和CD16b的切割位點并從人血白細胞克隆CD16a和CD16b的cDNA。以定向方式突變每一cDNA以誘導單個氨基酸改變。197位的絲氨酸變為脯氨酸(圖1B)。該突變阻斷CD16a和CD16b的切割，防止細胞活化時其下調。體外擴增的NK細胞中抗切割CD16a的表達維持該IgGFc受體的高表面水平，這增強NK細胞刺激、治療抗體功效和癌細胞殺傷。ADAM17具有許多細胞表面底物，但不具有可用于預測CD16a切割位點的蛋白質水解共有序列。因此，我們使用LC-MS-MS測定從活化的人外周血白細胞釋放的可溶性CD16中的C-端切割位點。我們在CD16的膜近側區(CD16a與CD16b之間相同的區域)觀察到極為接近的三個假定切割位點(圖2，箭頭)。盡管ADAM17蛋白質水解不需要共有序列，切割區域的二級結構很重要。試圖阻斷CD16a切割，我們用脯氨酸置換絲氨酸-197(CD16a197P)以引入構象變化。我們通過從活化NK細胞的培養基上清液，并分開地從中性粒細胞的培養基上清液免疫沉淀CD16而鑒定CD16切割的位置。用PNGaseF處理免疫沉淀的CD16以移除N-聚糖，胰蛋白酶消化，對所產生的肽進行質譜分析。鑒定到包含非胰蛋白酶C端的高置信度的四個不同肽譜（peptidepatterns）(圖1A)。對于從活化NK細胞的培養基上清液富集的CD16，我們僅觀察到一個肽譜，其對應于SEQIDNO:1的氨基酸甘氨酸-174至丙氨酸-195(肽#1,圖1A)。CD16a和CD16b的膜近側區，除了殘基176之外，具有相同的氨基酸序列。該位置處苯丙氨酸表示CD16a，其存在于肽#1中(圖1A和B)。該肽在丙氨酸-195/纈氨酸-196處顯示非胰蛋白酶P1/P1’切割位點(圖1B)。對于從活化的中性粒細胞的培養基上清富集的CD16，我們檢測到具有非胰蛋白酶C端的三個不同肽譜(肽#2-4，圖1A和1B)。肽#2對應于SEQIDNO:2的氨基酸甘氨酸-174至丙氨酸-195，肽#3對應于SEQIDNO:2的氨基酸甘氨酸-174至纈氨酸-196，肽#4對應于SEQIDNO:2的氨基酸天冬酰胺-180至蘇氨酸-198。肽#2和肽#3在176位包含纈氨酸，表示CD16b，并在丙氨酸-195/纈氨酸-196和纈氨酸-196/絲氨酸-197處顯示P1/P1’位點(圖1B)。肽#4在蘇氨酸-198/異亮氨酸-199處具有P1/P1’位點(圖1B)。盡管該肽從來自富集的中性粒細胞的可溶性CD16衍生，但其不包含176位的氨基酸來鑒定同種型(圖1B)。無論如何，高置信度肽顯示在CD16中的第三個切割位點。總之，這些發現證明CD16中存在切割區域而不是單個特異性切割位點。我們通過使用定點突變進一步檢查CD16的切割區域以確定在基于細胞的測定中是否可破壞CD16a和CD16b切割。ADAM17傾向于優選在底物區域中與其催化位點相互作用的α-螺旋構象。此外，ADAM17切割位點特異性的蛋白質組學研究顯示對在P1’、P2’或P3’位置處的脯氨酸殘基非常低的偏好性。因此我們用脯氨酸置換CD16a和CD16b切割區域中的絲氨酸-197(S197P，如圖2中所標明的)。在人腎細胞系HEK293中分別表達CD16b和CD16b/S197P，該細胞系不表達內源性CD16。HEK293轉染子在其表面以相似水平表達CD16b或CD16b/S197P(圖3A)。從轉染HEK293釋放高水平的CD16b，當用PMA處理它們時所述水平進一步增加，如通過ELISA所測定的(圖3A)。然而，未處理或PMA處理的HEK293細胞所產生的CD16b/S197P的可溶性水平與CD16b相比顯著更低(圖3A)。我們還使用相同方法檢查了S197P突變對CD16a切割的作用。CD16a的表面表達需要與γ鏈二聚體聯合。我們因此使用穩定表達人γ鏈的HEK293細胞。比較表達相等表面水平CD16a或CD16a/S197P的HEK293轉染子(圖3B)，我們測定未處理和PMA處理細胞的培養基上清液中每一受體的可溶性水平。再次，當與CD16a相比時觀察到顯著更低水平的可溶性CD16a/S197P(圖3B)。為了評估CD16中經工程改造的S197P突變是否可破壞ADAM17活性，我們還用L-選擇素，一個白細胞正常表達的很好地描述的ADAM17底物，轉染表達或缺乏CD16b/S197P的HEK293細胞。兩種轉染子表達相等水平的L-選擇素，所述L-選擇素水平在用PMA活化后相似地下調(圖3C)，證明S197P突變影響CD16脫落但不影響ADAM17活性。為了評估S197P突變對NK細胞中CD16a脫落的作用，我們使用人NK細胞系NK92(Gong等人，1994,Leukemia8:652-658)。這些細胞缺乏內源性CD16a的表達，但可穩定表達重組CD16a。我們轉導NK92細胞以分別表達CD16a和CD16a/S197P。用PMA活化表達相等水平這些受體的細胞并通過流式細胞術檢查細胞表面CD16水平。CD16a，而非CD16a/S197P，經歷細胞表面表達的顯著下調(圖4A)。IL-12和IL-18為NK細胞的生理刺激物，其單獨或組合可誘導CD16a脫落。用IL-12和IL-18處理的NK92細胞顯示CD16a而非CD16a/S197P在其細胞表面表達中相當可觀的下調(圖4B)。通過CD16a的結合IgG的細胞的直接參與（engagement）也可誘導其脫落，此處我們通過在抗-CD20mAb利妥昔單抗存在或不存在下將表達CD16a或CD16a/S197P的NK92細胞與CD20陽性Burkitt’s淋巴瘤細胞系Raji孵育來對其進行檢查。用利妥昔單抗處理的Raji細胞誘導CD16a而非CD16a/S197P的下調(圖4C)。BMS566394為高選擇性的ADAM17抑制劑，其具有對于ADAM17比對于其它金屬蛋白酶更高的效能數量級。BMS566394以與S197P突變相似的效率阻斷CD16a脫落，但對活化的表達CD16a/S197P的NK92細胞沒有額外的阻斷作用(圖4D)。這些發現提供ADAM17是在其切割區域內切割CD16a的主要脫落酶的進一步證據。然而，有可能ADAM17表達水平在表達CD16a或CD16a/S197P的NK92細胞中不相等，導致其不同的脫落。我們因此用多種抗-ADAM17mAbs染色表達CD16a或CD16a/S197P的NK92細胞并觀察到相同的細胞表面水平(圖4E)。為了確定S197P突變對原代NK細胞的CD16a脫落的作用，我們使用人iPSCs產生經工程改造的NK細胞。我們先前已經報道從iPSCs衍生功能NK細胞及其與外周血NK細胞的相似性(Knorr等人，2013StemCellsTranslMed.2:274-283;Ni等人，2014,StemCells32:1021-1031)。將CD16a和CD16a/S197PcDNA克隆入SleepingBeauty轉座子質粒用于基因插入和在iPSC細胞中穩定表達，所述iPSC細胞隨后分化為成熟NK細胞。從模擬轉導的iPSC細胞衍生的NK細胞表達低水平的內源性CD16a，而轉導的CD16a和CD16a/S197P以較高的水平表達(圖4F)。當與K562細胞相互作用時NK細胞活化通過多種受體(包括BY55/CD160)發生，導致ADAM17活化和CD16a脫落。我們用K562細胞刺激iPSC衍生的NK細胞，發現CD16a經歷顯著的細胞表面表達下調，而CD16a/S197P的表達保持穩定(圖4F)。內源和重組CD16a具有足夠的親和力以結合單體IgG。為了檢查S197P突變對CD16a功能的作用，我們比較CD16a和CD16a/S197P的IgG結合能力。以相等水平表達CD16a或CD16a/S197P的NK92細胞以相似的劑量依賴方式結合IgG(圖5A)。對照由結合到表達CD16a或CD16a/S197P的NK92細胞的IgA和結合到NK92親本細胞的IgG組成。二者均以基本的背景水平發生(圖5A)。這些發現證明通過CD16a和CD16a/S197P的特異和相等的IgG結合。CD16a是NK細胞上有效的活化受體，我們檢查了當抗體處理的腫瘤細胞參與時經工程改造的S197P突變是否影響CD16a誘導細胞活化的能力。NK92細胞活化通過測量CD107a的上調評估，其在脫粒時非常迅速地發生并且是NK細胞活化的靈敏標志。與用或不用利妥昔單抗處理的Raji細胞孵育的模擬轉導NK92細胞顯示低水平和相似上調的CD107a(圖5B)。當單獨與Raji細胞孵育時，以相等水平表達CD16a或CD16a/S197P的NK92細胞也少量上調CD107a，而其與用利妥昔單抗處理的Raji細胞的孵育導致CD107a的相當大上調(圖5B)。總之，上述發現表明CD16a中經工程改造的S197P突變不損傷其功能。因此，我們證明CD16a和CD16b中經工程改造的S197P突變在涉及天然ADAM17的基于細胞的測定中有效阻斷其脫落。CD16a中的S197P突變還阻斷人NK細胞系NK92中的受體脫落，但其不損傷受體功能。表達相等水平CD16a或CD16a/S197P的NK92細胞在一系列抗體濃度中以相似的效率結合單體IgG。另外，當結合到Raji細胞的利妥昔單抗參與時，表達CD16a或CD16a/S197P的NK92細胞以可比較的方式上調活化標志CD107a。多能干細胞允許遺傳操作以產生經工程改造的NK細胞。本公開內容描述從表達野生型CD16a或CD16a/S197P的轉導iSPCs產生經工程改造的NK細胞。與NK92細胞同樣，CD16a在iPSCs衍生的NK細胞中經歷脫落，證明當細胞活化時正常的ADAM17活性，而CD16a/S197P不脫落。CD16a和NK細胞細胞毒性功能在癌癥患者中可經歷相當大的下調。編碼CD16a/S197P的cDNA可用于產生穩定的人誘導多能干細胞(iSPCs)和胚胎干細胞(ESCs)。這些干細胞可然后分化為表達CD16a/S197P的原代NK細胞。表達抗切割CD16a/S197P(例如，單核細胞)或CD16b/S197P(例如，中性粒細胞)的其它細胞群也可從hESCs/iPSCs衍生。為了產生用在人類患者中對抗不同形式癌癥或感染的NK細胞免疫治療，CD16a/S197P-表達NK細胞可介導增加的抗體-依賴性細胞毒性(ADCC)活性或其它CD16a介導的活性(例如，IFNγ和TNFα產生)。例如，CD16a/S197P-表達NK細胞可與治療抗體(例如，曲妥單抗或利妥昔單抗)、雙特異性殺傷銜接體(BiKE，例如，CD16×CD33、CD16×CD19或CD16×EP-CAM雙特異性殺傷細胞銜接體)或三特異性殺傷細胞銜接體(TriKE)組合。也可產生具有增加的CD16-介導活性的其它治療細胞群(例如，中性粒細胞、單核細胞、T細胞，等)。CD16a/S197P在人iPSCs或人ESCs中的表達可產生具有增強的抗瘤病況例如，HER2卵巢癌的ADCC活性的NK細胞群。在一些情況下，瘤病況可用治療抗體例如，曲妥單抗處理。成熟NK細胞可從人胚胎干細胞和iPSCs衍生。可克隆野生型CD16a和/或CD16a/S197P以產生表達單獨的CD16a受體的穩定iPSC細胞系或穩定ESC細胞系。可使用任何合適的克隆方法。示例性克隆方法包括，例如，基于病毒的方法、轉座子載體(例如，SleepingBeauty)或核轉染。在一個實例中，iPSCs可使用SleepingBeauty轉座子載體來修飾。載體可包含選擇系統，例如，GFP/博來霉素（zeocin）抗性融合蛋白，其允許雙選擇系統(博來霉素抗性和流式細胞術分選)。iPSCs可分化為成熟NK細胞，如先前所描述的(Ni等人,2011,J.Virol.85:43–50;Knorr等人,2013,StemCellsTranslMed2:274–283;Woll等人,2009,Blood113:6094–6101)。iPSCs中轉基因受體的表達可導致衍生NK細胞中高水平表達。未分化iSPCs中CD16表達可破壞NK細胞分化。在這種情況下，CD16表達可使用，例如，CD56或天然CD16a啟動子推延，以致CD16a表達更好地與正常NK細胞分化一致。可比較表達相等水平野生型CD16a與CD16a/S197P的NK細胞。CD16構建體的表達水平可通過FACS分選基于GFP表達來匹配，所述GFP表達以與CD16a構建體成比例的方式發生。匹配的CD16a水平可通過FACS驗證。NK細胞抗HER2-表達卵巢癌細胞的細胞毒性可在治療抗體，例如，曲妥單抗存在或不存在下通過標準鉻釋放測定評估。可評估用非鉻標記卵巢癌細胞的抗體-依賴性細胞毒性。可通過ELISA評估NK細胞的細胞因子(例如，IFNγ、TNFα)產生和CD16a的可溶性水平，通過FACS評估CD16a和其它活化標志(例如，CD107a、CD62L)的細胞表面水平。實施例3中描述的人腫瘤異種移植模型可用于體內評估表達不可切割CD16a的NK細胞的抗癌活性。與人CD16不同，當細胞刺激時小鼠CD16不經歷胞外域脫落，因此確定CD16a脫落對NK細胞介導的ADCC的作用不能在正常小鼠中建立模型。表1提供實驗群組和處理的代表性集合。表1.腫瘤異種移植模型群組n處理#15無處理25僅OVCAR3細胞35OVCAR3+NK細胞/WT-CD16a45OVCAR3+NK細胞/WT-CD16a+曲妥單抗55OVCAR3+NK細胞/CD16a197P65OVCAR3+NK細胞/CD16a197P+曲妥單抗75OVCAR3+NK細胞/僅載體85OVCAR3+NK細胞/載體+曲妥單抗#處理至少進行兩次并匯總數據。腫瘤生長和/或消退可通過常規方法每周監測，包括，例如，生物發光成像、超聲、CT、MRI、另一種成像技術和/或稱重小鼠(Woll等人,2009,Blood113:6094–6101)。也可對小鼠采血(例如，每周)以定量人NK細胞存活。各種效應物功能標志(例如，IFNγ、CD16a)的表達和/或細胞表面水平可使用常規技術例如，通過FACS評估。小鼠可在任何適當時期，例如，60天期間隨訪。處死時，可檢查內臟(例如，脾、肝、肺、腎和/或卵巢)的轉移證據(例如，通過生物發光)，如先前所描述的(Woll等人,2009,Blood113:6094–6101)。我們的分析允許定義和比較表達野生型CD16a與CD16a/S197P的iPSC-衍生NK細胞的抗體-依賴性細胞毒性活性和體內效能。因此，我們在本文中描述修飾形式的CD16a、表達修飾的CD16a的遺傳修飾的細胞(例如，NK細胞、中性粒細胞、單核細胞、T細胞等)和涉及遺傳修飾的細胞的方法。例如，表達修飾形式的CD16a，CD16a/S197P的NK細胞顯示增加的抗卵巢癌活性，這至少部分上是由于減少的對NK細胞刺激時ADAM17-介導的脫落的敏感性。這繼而，在接合（engage）抗體-標記的癌細胞（例如用治療抗體標記的癌細胞）時，增加抗體-依賴性細胞毒性活性。此外，通過NK細胞的抗體識別增加與腫瘤細胞的接觸穩定性并通過其它活化受體（例如NKG2D）支持NK細胞活性。術語“和/或”意指一個或所有所列元素或兩個或更多個所列元素的組合；術語“包括”及其變體在說明書和權利要求中這些術語出現處不具有限制性含義；除非另外說明，“一個”、“一種”、“所述”和“至少一個”可交換地使用，意指一個或一個以上；通過端點敘述的數字范圍包括該范圍內包含的所有數字(例如，1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5，等)。在前述說明中，為了清楚起見可能分開描述具體的實施方案。除非另外清楚指明一個具體實施方案的特征與另一個實施方案的特征不相容，否則某些實施方案可包括與一個或多個實施方案有關的本文所描述的相容特征的組合。對于本文所公開的包括不連續步驟的任何方法，所述步驟可以以任何可行次序進行。并且，適當時，可同時進行兩個或更多個步驟的任何組合。本發明通過下列實施例說明。應理解的是具體的實施例、材料、量和程序應根據如本文所闡述的本發明的范圍和精神廣義解讀。實施例實施例1質譜法從健康個體采集外周血依照尼蘇達大學研究審查委員會(UniversityofMinnesotaInstitutionalReviewBoard)批準的方案根據方案#9708M00134進行。人中性粒細胞和NK細胞分離如先前所描述的進行(Wang等人,2013,BiochimBiophysActa.1833:680-685;Long等人,2010,JLeukocBiol.87:1097-1101;Long等人,2012,JLeukocBiol.92:667-672)。富集的中性粒細胞或NK細胞(在PBS中1×107/ml;Mediatech,Inc.Manassas,VA)用PMA(分別15ng/ml或50ng/ml;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在37℃活化30分鐘。過濾細胞上清液(0.45μm孔徑)并使用mAb3G8(BioLegend,Inc.,SanDiego,CA)和Pierce直接免疫沉淀試劑盒(ThermoFisherScientific,Rockford,IL)按照制造商的說明免疫沉淀CD16。純化的CD16通過靶向幾丁質結合結構域的Remove-iTPNGaseF(NewEnglandBioLabs,Inc.,Ipswich,MA)按照制造商的說明脫糖基化。簡言之，將10-20μg純化的CD16在40mMDTT存在下55℃變性10分鐘，然后用3μlRemove-iTPNGaseF(NewEnglandBioLabs,inc.,Ipswich,MA)在37℃孵育1小時。然后使用幾丁質磁珠從反應中去除Remove-iTPNGaseF。對CD16進行SDS-PAGE并通過氪熒光蛋白染色(ThermoFisherScientific,Rockford,IL)檢測可溶性CD16對應的凝膠帶，通過CD16免疫印跡分析同一凝膠中鄰近的泳道而驗證，然后將其切下并用胰蛋白酶對其進行標準凝膠內消化。將從凝膠提取的消化的肽干燥并在98:2:0.01的水:乙腈:甲酸中復溶用于液相色譜-質譜法分析，通過質譜法(VELOSOPBITRAP,ThermoFisherScientific,Rockford,IL)以數據依賴掃描模式分析≤1μg的等分試樣，如先前所描述的(Lin-Moshier等人,2013,JBiolChem.288:355-367)。數據庫檢索用ProteinPilot4.5(ABSciex,Framingham,MA)針對附加污染物數據庫(thegpm.org/cRAP/index,109蛋白質)的NCBI參考序列人蛋白質FASTA數據庫進行，所述ProteinPilot4.5使用Paragon評分算法(Shilov等人,2007,MolCellProteomics6:1638-1655)。檢索參數為：半胱氨酸碘乙酰胺；胰蛋白酶；儀器OrbiMS(1-3ppm)OrbiMS/MS；生物修飾ID焦點，其包括天冬酰胺脫酰胺；徹底的檢索努力；和假發現率分析(用相反的數據庫)。cDNA表達構建體的產生CD16b作為命名為NA1和NA2的兩個等位基因變體存在，其差異為在其胞外區域的N端部分的四個氨基酸。ADAM17以相似的效率切割兩個CD16b等位基因變體。對于本研究，我們僅檢查NA1變體。CD16a也存在兩個等位基因變體，它們在176位具有纈氨酸或苯丙氨酸殘基。ADAM17以相似的效率切割CD16a的這兩個等位基因變體。對于本研究，我們僅檢查纈氨酸等位基因變體CD16a。CD16a和CD16b從人白細胞cDNA擴增，如先前所描述的(Wang等人,2013,BiochimBiophysActa.1833:680-685;Dong等人,2014,ArthritisRheumatol.66:1291-1299)在BamHI和EcoRI限制酶位點單獨克隆入pcDNA3.1質粒(Invitrogen,Carlsbad,CA)。構建體然后按照制造商的說明進行Quik-ChangeSite-directedMutagenesis(快速改變定點誘變)(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)以將CD16a和CD16b中197位的絲氨酸轉換為脯氨酸。所有構建體經測序證實存在預期突變并且不存在任何自發突變。隨后將CD16acDNA在BamHI和EcoRI限制酶位點處克隆入Dr.G.Nolan(StanfordUniversity,Stanford,CA)提供的雙順反子逆轉錄病毒表達載體pBMN-IRES-EGFP。CD16a構建體還如先前所述(Wilber等人,2007,StemCells25:2919-2927;Tian等人,2009,StemCells27:2675-2685)克隆入雙順反子SleepingBeauty轉座子質粒(pKT2-IRES-GFP:zeo)中。簡言之，使用引物：5'-CCGGAATTCCAGTGTGGCATCATGTGGCAGCTGCTC-3'(正向,SEQIDNO:XX)和5'-CCGGAATTCTCATTTGTCTTGAGGGTCCTTTCT-3'(反向,SEQIDNO:YY)PCR擴增野生型CD16a和CD16a/S197P。有下劃線的是EcoRI位點。將EcoRI-消化的CD16a和CD16a/S197PPCR片段單獨克隆入pKT2-IRES-GFP:zeo中。正確的CD16a定向和序列通過PCR和測序分析確認。我們先前已經克隆了全長人L選擇素(CD62L)cDNA(Feehan等人,1996,JBiolChem.271:7019-7024;Matala等人,2001,JImmunol.167:1617-1623)，將所述全長人L選擇素(CD62L)cDNA在限制酶位點XbaI處轉移至pcDNA3.1載體中。如先前所述(Dong等人,2014,ArthritisRheumatol.66:1291-1299)克隆全長人FcRγcDNA，并修改為使用pcDNA3.1載體。表達重組L-選擇素、CD16a和CD16b的細胞系的產生HEK293細胞(人胚胎腎細胞系)和NK92細胞(人NK細胞系)(ATCC,Manassas,VA)按照貯藏所的說明培養。HEK293細胞使用Lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)按照制造商的說明用含有或不含CD16b、CD16b/S197P和/或L-選擇素的pcDNA3.1瞬時轉染。穩定表達人FcRγ的HEK293細胞通過同一方法用含有或不含CD16a或CD16a/S197P的pcDNA3.1瞬時轉染。NK92細胞通過先前所描述的逆轉錄病毒產生和感染程序(Matala等人,2001,JImmunol.167:1617-1623;Walcheck等人,2003,JLeukocBiol.74:389-394;Wang等人,2009,JImmunol.182:2449-2457)用含有或不含CD16a或CD16a/S197P的pBMN-IRES-EGFP穩定轉導。構建體表達通過EGFP熒光和CD16染色評估，如通過流式細胞術所測定的。人iPSCs(UCBiPS7,衍生自臍帶血CD34細胞)培養（maintained）在小鼠胚胎成纖維細胞上(Knorr等人,2013,StemCellsTranslMed.2:274-283;Ni等人,2014,StemCells32:1021-1031)。CD16a或CD16a/S197P的穩定表達如先前所述使用SleepingBeauty轉座子系統來進行(Wilber等人,2007,StemCells25:2919-2927;Tian等人,2009,StemCells27:2675-2685)。簡言之，用pKT2-IRES-GFP:zeo與在核轉染儀(nucleofector)溶液V中的轉座酶DNA的組合(LonzaInc.,Gaithersburg,MD)使用程序設置B16核轉染（nucleofect）iPSCs。核轉染的細胞立即懸浮在包含博來霉素(50μg/ml)的iPSC生長培養基中并接種到小鼠胚胎成纖維細胞上。從CD16a-hESC和CD16a-iPSC細胞衍生NK細胞hESCs和iPSCs的造血分化如先前所述(Ng等人,2005,Blood106:1601–1603;Ng等人,2008,NatProtoc3:768–776;LeGarff-Tavernier等人,2010,AgingCell9:527–535)進行。簡言之，在含有干細胞因子(SCF,40ng/ml)、血管內皮生長因子(VEGF,20ng/ml)和骨形態發生蛋白4(BMP4,20ng/ml)的BPEL培養基中在96孔圓底板的每孔中接種3000個單細胞。BPEL培養基包含Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium(IMDM,86ml,Invitrogen,ThermoFisherScientific,Inc.,Waltham.MA)、含GlutmaxI的F12營養混合液(NutrientMixture)(86mL,Invitrogen,ThermoFisherScientific,Inc.,Waltham.MA)、10%去離子牛血清白蛋白(BSA,5ml,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、5%聚乙烯醇(10ml,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、亞麻酸(20μl1gm/ml溶液，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、亞油酸(20μl1gm/ml溶液,Sigma)、Synthecol500x溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、a-monothioglyceral(3.9μl/100ml,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、無蛋白雜交瘤混合物II(Invitrogen,ThermoFisherScientific,Inc.,Waltham.MA)、抗壞血酸(5mg/ml,Sigma)、GlutamaxI(Invitrogen,ThermoFisherScientific,Inc.,Waltham.MA)、胰島素-轉鐵蛋白-硒100x溶液(Invitrogen,ThermoFisherScientific,Inc.,Waltham.MA)、青霉素/鏈霉素(Invitrogen,ThermoFisherScientific,Inc.,Waltham.MA)。在造血分化的第11天，將旋轉擬胚體（spinembryoidbodies）直接轉移至具有或不具EL08-1D2間質細胞的24孔板的提供有細胞因子的NK培養基中(LeGarff-Tavernier等人,2010,AgingCell9:527–535)。培養4-5周后，用APC-、PE-、FITC-和PerCP-cy5.5-偶聯的IgG或抗人血液表面抗原的特異性抗體：CD45-PE、CD56-APC、CD56-PE、CD16-PerCP-cy5.5、NKG2D-PE、NKp44-PE、NKp46-PE、CD158b-FITC、CD158e1/2-FITC(BDPharmingen,SanJose,CA)、CD158a/h-PE和CD158i-PE(BeckmanCoulter,Inc.,Pasadena,CA)染色單細胞懸液。抗體染色通過流式細胞術評估。細胞刺激分別用15ng/ml和100ng/mlPMA在37℃活化RPMI1640培養基(Mediatech,Inc.,Manassas,VA)中的HEK293和NK92細胞30分鐘。NK92細胞用IL-12(PeproTechInc,RockyHill,NJ)和IL-18(R&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN)分別以100ng/ml和400ng/ml活化達到標明的時間點。通過CD16a的NK92細胞活化通過與用抗-CD20mAb利妥昔單抗(1μg/ml)(Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA)處理的CD20-陽性Burkitt’s淋巴瘤細胞系Raji(ATCC，按照貯藏所的說明生長)(1:1比率)孵育而介導，如先前所描述的(Romee等人,2013,Blood121:3599-3608)。通過洗滌Raji細胞去除過量的利妥昔單抗。在一些實驗中，NK92細胞用選擇性ADAM17抑制劑BMS566394(5μM)(Bristol-MyersSquibbCompany,Princeton,NJ)預孵育30分鐘。從iPSCs衍生的NK細胞用人紅白血病細胞系K562(ATCC，按照貯藏所的說明生長)刺激，如先前所描述的(Romee等人,2013,Blood121:3599-3608)。簡言之，與K562靶細胞(2:1比例)在37℃孵育iPSC-衍生的NK細胞4小時。抗體結合測定細胞與單體人IgG和IgA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的結合如先前所述(Dong等人,2014,ArthritisRheumatol.66:1291-1299)實施，并進行了一些修改。PBS中5×106/ml的NK92親本細胞或表達CD16a或CD16a/S197P的轉導細胞在4℃用IgG或IgA以標明的濃度一式三份孵育1小時。充分洗滌細胞并用APC-綴合的驢抗人Fc(重鏈和輕鏈)抗體(JacksonImmunoresearch,WestGrove,PA)按照制造商的說明進行孵育。洗滌細胞，然后立即通過流式細胞術分析。流式細胞術和ELISA對于細胞染色，阻斷非特異性抗體結合位點，細胞用標明的抗體染色并通過流式細胞術檢查，如先前所描述的(Wang等人,2013,BiochimBiophysActa.1833:680-685;Romee等人,2013,Blood121:3599-3608)。流式細胞術分析在FACSCanto和LSRII儀器(BDBiosciences,SanJose,CA)上進行。人CD16通過mAbs3G8(BioLegend,Inc.,SanDiego,CA)和DJ130c(SantaCruzBiotech,SantaCruz,CA)檢測。CD107a通過mAbH4A3(Biolegend,Inc.,SanDiego,CA)檢測。ADAM17通過mAbsM220(Doedens等人,2000,JBiolChem.275:14598-14607)、111633和111623(R&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN)檢測。人L-選擇素通過mAbLAM1-116(AncellCorp.,Stillwater,MN)檢測。同種型匹配的陰性對照mAbs用于評估非特異性染色水平。CD16ELISA通過定制的流式微球測定（cytometricbeadassay）進行，如先前所描述的(Wang等人,2013,BiochimBiophysActa.1833:680-685)。統計分析統計分析使用Prism軟件(GraphPad,SanDiego,CA)適當時使用ANOVA和學生t檢驗進行。認為P值<0.05是顯著的。實施例2表達相等水平WTCD16a和CD16a197P(CD16a/S197P)的NK細胞的比較CD16構建體的表達水平通過FACS分選基于GFP表達匹配(如上述對于NK92細胞進行的，圖2)，所述GFP表達以與CD16構建體成比例的方式發生。對于所有測定匹配的CD16a水平通過FACS驗證。作為對照，評估用空SleepingBeauty轉座子載體修飾的iPSC-衍生NK細胞(僅表達GFP)。iPSC-衍生的NK細胞表達低水平的內源性CD16a(數據未示出)。NK細胞對HER2-表達卵巢癌細胞的細胞毒性在曲妥單抗的存在或不存在下通過標準鉻釋放測定評估。也進行了用非鉻標記卵巢癌細胞的抗體-依賴性細胞毒性。NK細胞的細胞因子(例如，IFNγ、TNFα)產生和CD16a的可溶性水平通過ELISA評估。CD16a和其它活化標志(例如，CD107a、CD62L)的細胞表面水平通過FACS評估。實施例3人腫瘤異種移植模型，其用于檢驗表達CD16a197P(CD16a/S197P)的iPSC-衍生NK細胞在曲妥單抗存在下是否具有增加的體內抗卵巢癌活性。使用NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠和經穩定工程改造而表達用于生物發光成像的螢火蟲熒光素酶的人卵巢癌細胞系的異種移植模型(Geller等人,2013,Cytotherapy15:1297–1306)用于檢驗腹膜內(ip)遞送NK細胞的抗卵巢癌細胞活性。過表達HER2的OVCAR3卵巢癌細胞系用作體內靶(Hellstrom等人,2001,CancerRes61:2420–2423)。亞致死照射的(225cGY)NSG雌性小鼠腹膜內注射表達熒光素酶用于生物發光成像而產生的OVCAR3(2×105細胞)以定量腫瘤生長或消退(Geller等人,2013,Cytotherapy15:1297–1306)。在小鼠得到單次腹膜內注射20×106NK細胞前，讓腫瘤生長7天。然后每隔一天給予小鼠IL-2(5μg/小鼠)，持續4周，如先前所描述的(Woll等人,2009,Blood113:6094–6101)，以促進NK細胞的體內存活。曲妥單抗以50μg的劑量腹膜內給予，每周一次，持續4周(所述劑量為先前在該模型中使用的劑量)(Warburton等人,2004,Clinicalcancerresearch10:2512–2524)。比較表達相等水平WTCD16或CD16a197P(CDa6a/S197P)的iPSC-衍生NK細胞的體內效能。對照包括僅表達GFP(僅載體)的iPSC-衍生NK細胞，和僅接受卵巢癌細胞的小鼠同齡組。所有小鼠得到相同的IL-2處理。腫瘤生長/消退每周通過生物發光成像和稱重小鼠監測，如先前所描述的(Woll等人,2009,Blood113:6094–6101)。每周還對小鼠采血以定量人NK細胞存活。各種效應物功能標志(例如，IFNγ、CD16a)的表達/細胞表面水平通過FACS評估。對小鼠隨訪達~60天。處死時，通過生物發光檢查內臟(例如，脾、肝、肺、腎和/或卵巢)的轉移證據，如先前所描述的(Woll等人,2009,Blood113:6094–6101)。示例性實施方案實施方案1.一種經遺傳修飾以表達包含膜近側區和膜近側區中的氨基酸修飾的CD16多肽的細胞。實施方案2.一種細胞，包含：編碼包含膜近側區和膜近側區中的氨基酸修飾的CD16多肽的多核苷酸。實施方案3.實施方案1或實施方案2的細胞，其中所述氨基酸藥物（medication）反映與CD16膜近側區野生型氨基酸序列相比一個或多個氨基酸的添加、一個或多個氨基酸的缺失，或一個或多個氨基酸的置換。實施方案4.實施方案3的細胞，其中一個或多個氨基酸的置換包括SEQIDNO:1的197位的絲氨酸殘基的置換。實施方案5.任何前述實施方案的細胞，其中所述細胞為自然殺傷(NK)細胞。實施方案6.任何前述實施方案的細胞，其中所述細胞為中性粒細胞。實施方案7.任何前述實施方案的細胞，其中所述細胞為單核細胞。實施方案8.任何前述實施方案的細胞，其中與野生型CD16多肽相比所述修飾的CD16多肽顯示減小的對ADAM17介導的脫落的敏感性。實施方案9.任何前述實施方案的細胞，其中與野生型CD16多肽相比所述修飾的CD16多肽顯示減小的對NK細胞刺激時的切割的敏感性。實施方案10.一種方法，其包括給予需要這種處理的患者包括以下的治療：給予患者治療性NK效應物，和給予患者權利要求1-9中任一項的細胞。實施方案11.實施方案10的方法，其中所述治療性NK效應物包括治療劑。實施方案12.實施方案11的方法，其中所述治療劑特異性識別腫瘤抗原。實施方案13.實施方案12的方法，其中所述治療劑包括特異性識別腫瘤抗原的抗體或抗體片段。實施方案14.實施方案13的方法，其中所述腫瘤抗原包括HER2。實施方案15.實施方案13或實施方案14的方法，其中所述抗體包括曲妥單抗或利妥昔單抗。實施方案16.實施方案10的方法，其中所述治療性NK效應物包括雙特異性殺傷銜接體(BiKE)。實施方案17.實施方案16的方法，其中所述BiKE包括CD16×CD33BiKE、CD16×CD19BiKE或CD16×EP-CAMBiKE。實施方案18.實施方案10的方法，其中所述治療性NK效應物包括三特異性殺傷細胞銜接體(TriKE)。實施方案19.實施方案11或16-18中任一項的方法，其中所述治療劑特異性識別病毒靶。實施方案20.用于改善對患者的治療的方法，所述治療包括給予患者治療性NK效應物，所述方法包括：給予患者權利要求1-9中任一項的細胞。本文所引用的所有專利、專利申請和出版的完整公開內容以及電子可得的材料(包括，例如，核苷酸序列提交（例如GenBank和RefSeq中的）以及氨基酸序列提交（例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的）和來信GenBank和RefSeq中注釋的編碼區域的翻譯)通過引用以其整體結合。如果本申請的公開內容與本文通過引用結合的任何文獻的公開內容之間存在任何不一致，應以本申請的公開內容為準。前面的詳述和實施例僅為了清楚理解給出。不應從其理解不必要的限制。本發明不限于所顯示和描述的確切細節，因為對本領域技術人員顯而易見的變更將包含在通過權利要求書界定的本發明內。除非另外說明，說明書和權利要求書中使用的表述組分的量、分子量等的所有數字在所有情況下應理解為被術語“約”修飾。相應地，除非另外指示相反，說明書和權利要求書中列出的數字參數為近似值，其可根據欲通過本發明獲得的期需性質而改變。至少，并且不試圖將等同物的教義限制在權利要求書的范圍中，每一數字參數應至少根據所報道的有效數字的數并通過應用普通舍入技術來解釋。盡管闡述本發明的廣泛范圍的數字范圍和參數為近似值，但具體實施例中列出的數值仍盡可能準確地報告。然而，所有數值固有地包含由其各自的檢驗測量結果中存在的標準偏差所必然得出的范圍。所有的標題均為了方便讀者并且不應用于限制標題之后的正文的含義，除非如此說明。當前第1頁1 2 3