RBBP4靶向多肽和抗腫瘤多肽及其應用的制作方法

本發明涉及腫瘤靶向治療領域，更特別地，涉及一種RBBP4靶向多肽和一種抗腫瘤多肽及其應用。

背景技術：

惡性腫瘤嚴重威脅人類健康，是世界范圍內一個主要的致死因素。常規的腫瘤治療手段包括化療、放療、手術切除等。但這些方法通常會對機體的正常組織帶來損傷，造成很大的毒副作用，給腫瘤患者帶來極大的痛苦。因此，特異性高、療效顯著的腫瘤靶向治療方法引起了人們的極大興趣。

腫瘤靶向療法指通過干擾參與腫瘤細胞發生、發展和擴散相關的特殊分子，進而抑制腫瘤進展的治療方法。腫瘤靶向療法區別于傳統化療，有其特定的靶標分子，人們也正在努力開發各種腫瘤靶向療法。目前認為，靶向性多肽是比較理想的腫瘤靶向治療手段，具有以下優勢：1)血漿清除速度快，親和力高，特異性強；2)良好的組織穿透性，能被腫瘤細胞攝取；3)易于化學合成，且免疫原性低，可避免單克隆抗體治療的不足。因此，近年來許多學者應用肽庫技術尋找可能與腫瘤細胞特異結合的短肽，以達到靶向治療腫瘤的目的。

多梳抑制復合物2(PRC2)是一類重要的表觀遺傳抑制復合物，能通過調控組蛋白H3第27位賴氨酸的三甲基化(H3K27)，抑制基因的轉錄。PRC2在腫瘤的發生、發展中具有重要作用。相對于正常細胞，腫瘤細胞中PRC2復合物對抑癌基因的抑制活性顯著增強。PRC2在腫瘤中的關鍵作用使得它成為腫瘤表觀遺傳療法的重要靶標。PRC2與多種腫瘤，如結腸癌、乳腺癌、白血病、肝癌、口腔癌的相關性已引起人們日益增多的關注。

人類PRC2復合物由四個核心組分組成，即，胚胎外胚層發育蛋白(EED)、果蠅zeste基因增強子同源物2(EZH2)、Zeste人12同源物1抑制因子2(SUZ12)和RBBP4。其中，EZH2是核心催化亞基，RBBP4與SUZ12負責結合核小體，EED能增強EZH2的催化作用。已有多項研究針對EZH2設計多肽及藥物，抑制其功能，達到治療腫瘤的作用，然而尚缺乏針對RBBP4蛋白設計的多肽或藥物研究。

RBBP4蛋白是WD40家族中的一員，定位于細胞核內，能直接結合組蛋白H3-H4復合物，也參與多種組蛋白結合復合物的形成；除PRC2復合物以外，RBBP4參與組蛋白去乙酰化酶(HDAC)復合物、核小體重塑脫乙酰基酶(NuRD)復合物的形成，調節染色質結構及功能。對RBBP4進行靶向結合，能削弱PRC2復合物的形成，并抑制其催化活性，從而達到治療腫瘤的效果。

細胞穿膜肽(CPP)是一類具有很強穿透細胞膜能力的短肽，具有正電荷，既可以從生物體內提取，也可以通過人工合成。該多肽可以直接穿透細胞膜，進入細胞漿和細胞核，有利于進一步作為載體攜帶藥物進行抗腫瘤治療。同時，對正常組織毒副作用小，從根本上改善基因治療的安全與倫理問題。對進一步研制高效、安全的靶向治療藥物具有重要意義，可望推動惡性腫瘤分子靶向治療的發展與進程。

因此，需要構建一種既能靶向腫瘤細胞，又能高效入胞的新型多肽。

技術實現要素：

為解決以上問題，發明人制備了一種靶向RBBP4的多肽，并將該多肽與細胞穿膜肽通過共價鍵連接起來，達到既有靶向腫瘤細胞，又具有高效入胞的效果。

基于該研究，本發明提供了一種RBBP4靶向多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發明還提供了上述RBBP4靶向多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發明還提供了一種抗腫瘤多肽，其包括RBBP4靶向結構域和穿膜結構域，所述RBBP4靶向結構域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

優選地，所述穿膜結構域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

優選地，所述RBBP4靶向結構域位于所述抗腫瘤多肽的C端，并且所述穿膜結構域位于N端。

本發明還提供了上述抗腫瘤多肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發明的優點在于，本發明的抗腫瘤多肽的穿膜結構域本身沒有細胞毒性，但連接RBBP4靶向結構域后，有明顯的抑制腫瘤增殖、遷移侵襲的效應。本發明的抗腫瘤多肽，不僅可以單獨作為抗腫瘤的生物治療藥物，還有望結合其他治療方式來抑制腫瘤。

附圖說明

圖1為用RBP-25和對照多肽孵育腫瘤細胞后的熒光顯微鏡照片；

圖2為不同濃度的RBP-25對SW480增殖活性影響的統計圖；

圖3為不同濃度的RBP-25對SK-N-SH增殖活性影響的統計圖；

圖4為RBP-25處理不同時間對SW480增殖活性影響的統計圖；

圖5為RBP-25處理不同時間對SK-N-SH增殖活性影響的統計圖；

圖6為Transwell實驗的結晶紫染色照片；

圖7為根據圖6計數得到的IMR32細胞的Transwell實驗的細胞計數圖；

圖8為根據圖6計數得到的SK-N-SH細胞的Transwell實驗的細胞計數圖；

圖9為倒置顯微鏡下動態觀察HUVEC小管形成的照片；

圖10為RBBP4抗體免疫沉淀EZH2/SUZ12的western blot檢測照片；

圖11為RBP-25處理后SK-N-SH細胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的western blot檢測照片；

圖12為RBP-25處理后MCF-7細胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的western blot檢測照片；

圖13為RBP-25處理后SK-N-SH細胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的相對轉錄水平；

圖14為RBP-25處理后MCF-7細胞中CHL1、IGFBP5、PMP22、PTPRZ1和PTRF的相對轉錄水平。

具體實施方式

以下結合實例對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。

1.RBBP4靶向多肽的鑒定以及抗腫瘤多肽的合成

通過生物信息學和蛋白定點突變技術，獲取針對RBBP4的多肽氨基酸序列SEQ ID NO:2。

通過固相合成法合成一種抗腫瘤多肽，其包括RBBP4靶向結構域和穿膜結構域(SEQ ID NO:1)，為了研究方便，我們還在RBBP4靶向結構域的C端標記的異硫氰酸熒光素標記，氨基酸序列為YGRKKRRQRRR-MEILQSDYILAQVK-FITC(命名為RBP-25)，由武漢百意欣生物技術有限公司合成。

合成步驟如下：

1)稱取n當量樹脂放入反應器，加入二氯甲烷(DCM)溶脹半小時，然后抽掉DCM，加入序列中第一個氨基酸2n當量，加2n當量的二異丙基乙胺(DIEA)，適量的二甲基甲酰胺(DMF)、DCM(適量是指以可使樹脂充分鼓動起來為宜)、DIEA、DMF、DCM，氮氣鼓泡反應60分鐘。然后加入約5n當量甲醇，反應半小時，抽掉反應液，用DMF、甲醇洗凈。

2)往反應器中加入序列中第二個氨基酸(也為2n當量)，2n當量1-羥基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸鹽(HBTU和DIEA，氮氣鼓泡反應半小時，洗掉液體，茚三酮檢測，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗凈，加入適量的脫帽液去除9-芴甲氧羰基(Fmoc)保護基，洗凈，茚三酮檢測。

3)依步驟2)的方式依次加入序列中不同的氨基酸并進行各種修飾。

4)將樹脂用氮氣吹干后從反應柱中取下，倒入燒瓶中，然后往燒瓶中加一定量(切割液和樹脂大約以10ml/克的比例)的切割液(組成是95％三氟乙酸、2％乙二硫醇、2％三異丙基硅烷、1％水)，震蕩，濾掉樹脂。

5)得到濾液，然后向濾液中加入大量乙醚，析出粗產物，然后離心，清洗即可得到序列的粗產物。

多肽純化：反相高效液相色譜法純化粗品，多肽通過疏水作用連接到柱填料上，漸次降低離子強度進行洗脫。

采用紫外分光光度法測定多肽紫外吸收進行定量。結果顯示成功合成該多肽，并且純度為95％以上。

多肽凍干：純化好的液體放入凍干機中進行濃縮，凍干成白色粉末。

儲存：凍干多肽放在-70℃條件下可以保存一年以上，避免紫外線等劇烈物理環境，避免反復凍融。

用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)將多肽稀釋為1mM的儲存液分裝后避光凍存于-70℃備用。

2.RBP-25多肽穿膜及細胞定位實驗

分別采用人乳腺癌細胞系MCF-7、人神經母細胞瘤細胞系IMR32進行檢測。將對數期生長的細胞種植在24孔板內的蓋玻片上，每孔約15000個細胞。以10％胎牛血清，高糖DMEM培養基培養，并加入30μM的多肽，維持48小時。以與該多肽相同組成的氨基酸隨機重新排列后的錯序肽作為對照肽。

棄去培養基，加入4％多聚甲醛300μl/孔，室溫固定細胞20分鐘，棄去多聚甲醛，1x PBS清洗兩次，每次5分鐘。

加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液300μl/孔，室溫染細胞核5分鐘，1x PBS充分洗滌5次，每次5分鐘。純甘油封片，將蓋玻片固定于載玻片上。采用激光共聚焦顯微鏡檢測帶有熒光基團的多肽在細胞內的定位，拍照并保存。

以上實驗結果在相同條件下重復三次。

實驗結果如圖1所示，該多肽在加入細胞培養體系48小時之后，能有效與腫瘤細胞結合，并顯示強胞漿及胞核染色。而對照肽僅能部分進入細胞漿，少量分布在細胞核。實驗結果表明，該多肽能夠有效進入腫瘤細胞的胞漿和胞核內。

3.RBP-25多肽抑制細胞增殖活性實驗

采用MTT法檢測該多肽對不同腫瘤細胞的增殖活性影響。分別使用人結腸癌細胞系SW480、人神經母細胞瘤細胞系SK-N-SH進行檢測。以與該多肽相同組成的氨基酸隨機重新排列后的錯序肽作為對照肽。

在96孔細胞培養板中，每孔種植5000個細胞培養，每個樣品設定10個復孔。24小時后，加入多肽。多肽及其對照多肽濃度分別為10μM、30μM、50μM、100μM；作用時間分別為為24小時、48小時、72小時。

到達標定時間之后，吸棄培養上清，用1×PBS清洗樣品孔3次，每次5分鐘。再向樣品孔中加入100μl二甲基亞砜(DMSO)溶液。將培養板靜置于37℃，10分鐘。取出后輕輕混勻孔內樣品。用酶標儀檢測570nm吸光度。收集數據，計算并統計。

以上實驗在相同條件下重復三次。

實驗結果如圖2-5所示，該多肽能顯著抑制腫瘤細胞SW480和SK-N-SH的增殖活性，其效果在30μM濃度以上(圖4和5)48小時后(圖2和3)較為明顯。而對照肽并不體現出明顯的抑制增殖效應。

4.RBP-25多肽抑制細胞遷移活性檢測

細胞遷移實驗可以通過檢測腫瘤細胞趨營養穿透Transwell微孔薄膜進行檢測。

在24孔培養板中放置Transwell小室(購自Corning公司，貨號：3421)，向底層加入含15％胎牛血清的完全培養基，并向培養基中加入不同濃度的多肽。

用無血清培養基制備單細胞懸液，計數后，以200μl無血清培養基中2×10⁴個細胞的濃度向Transwell上室中加入200μl細胞懸液，約2×10⁴個細胞。并向上室內加入與下室相同濃度的多肽。

于5％二氧化碳、37℃培養24小時。取出小室放入4％多聚甲醛中固定20分鐘，再放入0.5％結晶紫染色液中染色2小時。

用棉簽輕輕去除上室中未穿過多孔膜的細胞，在倒置顯微鏡下對多孔膜進行照相計數。

實驗結果如圖6-8所示，RBP-25能顯著抑制腫瘤細胞遷移活性并呈劑量依賴性。而對照多肽并不體現出明顯的抑制效應。

5.RBP-25多肽抑制腫瘤細胞血管生成活性檢測

腫瘤細胞血管生成活性，可以通過檢測人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)在細胞外基質膠(matrigel)中的生長與血管形成狀態來進行檢測。

具體實施方式如下：

在12孔板中以80％細胞密度鋪板，每孔加入1ml培養基，再加入不同濃度的多肽，同時設對照孔；

在37℃、5％CO₂環境培養48小時，收集培養孔內的上清液，標記好凍存在-80℃備用；

從-20℃取出基質膠，在冰水浴中復溫至融解狀態。取96孔細胞培養板，每孔加入50μl基質膠至孔底，水平放置于37℃培養箱30分鐘，待基質膠凝固；

制備HUVEC單細胞懸液，計數后，向96孔板每孔加入3000個細胞，再加入收集的腫瘤細胞培養上清100μl；

在37℃、5％CO₂環境培養6-8小時，在倒置顯微鏡下動態觀察HUVEC小管形成狀態，適時拍照。

實驗結果如圖9所示，RBP-25能顯著抑制腫瘤細胞血管形成活性，并呈劑量依賴性。而對照度肽并不體現出明顯的抑制效應。

6.RBP-25多肽抑制蛋白相互作用的免疫共沉淀檢測

采用SK-N-SH細胞檢測多肽對RBBP4蛋白與PRC2復合物組分EZH2、SUZ12相互作用的抑制效應。向10cm培養皿中培養的細胞加入不同濃度的多肽(0、10、30、50、100μM)，同時另設對照多肽加入組，處理48小時；

0.25％胰蛋白酶消化，收集細胞，1×PBS洗滌，去除上清；

用RIPA(弱)裂解液1ml充分裂解細胞團塊，將裂解液分為3等份，取50μl作為總蛋白對照組凍存于-70℃，余下450μl作為免疫共沉淀組，加入30μl預混勻蛋白瓊脂糖純化樹脂，1.5μg RBBP4抗體/EZH2抗體/SUZ12抗體，置于4℃冰箱以10rpm旋轉混勻過夜；

取出過夜混勻的試管，3000rpm離心1分鐘，棄上清，加入1ml 1×PBS重懸瓊脂糖珠，3000rpm離心1分鐘，小心吸去上清，反復4-5次，將未結合瓊脂糖珠的部分清洗棄去。最后一次洗滌后，小心去除上清，保留20-30μl PBS；

加入20-30μl 2×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣緩沖液，混勻后95℃水浴10分鐘，解離瓊脂糖珠上的蛋白；

制備12％SDS-PAGE膠，電泳后按照分子量切取48KD(RBBP4)、102KD(EZH2)、83KD(SUZ12)的條帶，轉膜封閉，相應抗體孵育后曝光。根據條帶的明暗判讀不同濃度的多肽對RBBP4與EZH2及SUZ12相互作用的抑制效果。

實驗結果如圖10所示，采用Western blot檢測，總蛋白對照組顯示每組蛋白上樣量相等，Co-IP組顯示隨著多肽濃度的提高，以RBBP4抗體免疫沉淀獲得的EZH2/SUZ12蛋白逐漸減少，說明PRC2復合物的組建受到一定程度的抑制。

7.RBP-25多肽對于RBBP4下游基因的調節作用

通過生物信息學芯片分析，結合實時定量PCR分析，獲得了數個與RBBP4在腫瘤細胞中作用時的下游靶基因，且均為抑癌基因。認為RBBP4的作用促進了PRC2復合物在這些基因的啟動子區域結合，抑制了這些基因的轉錄與表達，從而促進腫瘤的發生發展；

獲得的基因如下：L1CAM同源物細胞粘附分子(CHL1)、胰島素樣生長因子結合蛋白5(IGFBP5)、外周髓鞘蛋白-22(PMP22)、蛋白酪氨酸磷酸酶受體Z1(PTPRZ1)、RNA聚合酶1和轉錄釋放因子抗體(PTRF)；

根據NCBI提供的基因序列設計了針對這五個基因的特異引物，用于實時定量PCR檢測其轉錄水平變化；

購買了這些基因的相應蛋白抗體，進行蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測蛋白水平；

取對數生長期的腫瘤細胞，向培養體系中加入不同濃度的多肽(0、10、30、50、100μM)，處理48小時之后，收集細胞；

取部分細胞提取RNA，經逆轉錄之后用步驟3所設計的特異性引物進行實時定量PCR分析檢測；

取部分細胞提取總蛋白，測定濃度，變性之后采用SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜孵育抗體后分別檢測五個靶基因的蛋白表達水平。獲取多肽調節五個靶基因的蛋白水平數據。

實驗結果如圖11-14所示，該多肽能提升RBBP4下游靶基因的轉錄及蛋白翻譯水平，隨著多肽濃度的增加，該作用更為明顯，證明該多肽確實能對抗PRC2復合物對抑癌基因的抑制作用，發揮抑制腫瘤發生、發展的作用。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

序列表

<110> 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院

<120> RBBP4靶向多肽和抗腫瘤多肽及其應用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Ile Leu Gln Ser Asp Tyr Ile Leu Ala Gln Val Lys

1 5 10