腫瘤抗原NY?ESO?1的CTL識別表位肽及其應用的制作方法

本發明涉及表位肽技術領域，尤其涉及一種特異性腫瘤抗原NY-ESO-1的CTL識別表位肽及其應用，還涉及一種腫瘤抗原NY-ESO-1特異性DC細胞的制備方法及其應用，以及一種腫瘤抗原NY-ESO-1特異性DC-CIK細胞的制備方法及其應用。

背景技術：

腫瘤-睪丸抗原(Cancer-testis Antigen，CTA)，主要在正常睪丸和多種腫瘤組織中表達，在其他正常組織中幾乎不表達。NY-ESO-1是腫瘤-睪丸抗原家族中的一種，定位于X染色體，編碼一種膜相關蛋白,是所知的免疫原性最強的腫瘤抗原之一，能同時引起細胞免疫和體液免疫。NY-ESO-1在如食管癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌等多種類型的腫瘤中廣泛表達，在NY-ESO-1陽性的腫瘤患者體內常可以檢測到NY-ESO-1抗體的存在，提示其可以作為腫瘤治療潛在靶點。

隨著生物技術的快速發展以及對腫瘤發生發展機制研究的深入，腫瘤免疫治療領域不斷取得新的成果，其中，過繼性細胞免疫治療是該領域的熱點。過繼性細胞免疫治療是指從自體或異體提取免疫細胞并在體外擴增培養達一定數量后再回輸病人體內，實現抗瘤作用的治療方法。過繼性細胞免疫治療能夠避開體內腫瘤免疫障礙的多種機制，調動機體自身的免疫功能來發揮抗瘤作用。

目前用于過繼性細胞免疫治療的細胞主要有NK、DC-CIK等，其中DC-CIK細胞免疫療法就是將DC細胞和CIK細胞共培養獲得的一種新的具有特異性抗瘤活性的細胞群。DC-CIK細胞可以顯著抵制腫瘤細胞的生長、增殖，幫助機體恢復同腫瘤細胞作斗爭的能力，最大限度地調動人體免疫功能，全方位防止復發和轉移，明顯改善患者的生活質量，有效延長患者的壽命。

目前，用于有效誘導DC-CIK細胞的抗原十分有限，發現以及制備能夠高效刺激腫瘤特異性DC-CIK的CTL表位多肽抗原將會提高這一技術的實用性。

技術實現要素：

基于背景技術存在的技術問題，本發明目的在于提供一種特異性腫瘤抗原NY-ESO-1的CTL識別表位肽。

本發明目的還在于提供上述特異性腫瘤抗原NY-ESO-1的CTL識別表位肽的應用。

本發明目的還在于提供一種腫瘤抗原NY-ESO-1特異性DC細胞的制備方法。

本發明目的還在于提供一種腫瘤抗原NY-ESO-1特異性DC-CIK細胞的制備方法。

本發明目的還在于提供上述腫瘤抗原NY-ESO-1特異性DC細胞和DC-CIK細胞的應用。

為實現上述目的，本發明采取如下技術方案：

本發明提出的一種特異性腫瘤抗原NY-ESO-1的CTL識別表位肽，所述CTL識別表位肽為十五肽，其氨基酸序列如下：Gly-Ala-Ala-Arg-Ala-Ser-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly-Ala-Pro-Arg-Gly，分子量為1238.34。

上述特異性腫瘤抗原NY-ESO-1的CTL識別表位肽采用固相合成法進行合成。基本流程如下：首先將一個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護基，第一個氨基酸即連接至固相載體上；其次將第二個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個氨基酸羧基再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重復上述的肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目的肽，再經HPLC純化，其純度大于90％。

本發明還提出的上述特異性腫瘤抗原NY-ESO-1的CTL識別表位肽在制備具有NY-ESO-1表達的腫瘤治療性多肽疫苗的應用。

優選地，上述特異性腫瘤抗原NY-ESO-1的CTL識別表位肽在制備黑色素瘤治療性多肽疫苗中的應用，尤其對黑色素瘤細胞A375具有殺傷力。

本發明還提出的一種腫瘤抗原NY-ESO-1特異性DC細胞的制備方法，采用上述特異性腫瘤抗原NY-ESO-1的CTL識別表位肽加入DC細胞進行培養得到。

本發明還提出的上述腫瘤抗原NY-ESO-1特異性DC細胞的制備方法得到的特異性DC細胞在制備治療黑色素瘤藥物中的應用。

本發明還提出的一種腫瘤抗原NY-ESO-1特異性DC-CIK細胞的制備方法，采用上述特異性腫瘤抗原NY-ESO-1的CTL識別表位肽進行誘導得到。

本發明還提出的上述腫瘤抗原NY-ESO-1特異性DC-CIK細胞的制備方法得到的特異性DC-CIK細胞在制備治療黑色素瘤藥物中的應用。

本發明巧妙利用NY-ESO-1在多種常見腫瘤如神經母細胞瘤、滑膜肉瘤、惡性黑色素瘤、卵巢上皮癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌等均存在生存素(NY-ESO-1)異常表達，但在正常成人組織除睪丸外不表達或呈低表達。理論和實驗相結合的方法篩選得到腫瘤相關抗原的表位肽，所得表位肽未見文獻報道，為研制基于抗原NY-ESO-1的腫瘤疫苗或腫瘤特異性CTL細胞的制備提供理論基礎，并為后續多價的抗原肽疫苗構建奠定基礎。

附圖說明

圖1為本發明提出的一種特異性腫瘤抗原NY-ESO-1的CTL識別表位肽的質譜分析圖。

圖2為本發明實施例1所得P1、P2、P3……P20各自誘導得到的特異性CTL細胞分泌INF-γ的能力對比圖。

圖3為本發明實施例1所得P3、P5、P7各自誘導得到的特異性CTL細胞對黑色素瘤細胞A375殺傷能力對比圖。

圖4由本發明提出的一種特異性腫瘤抗原NY-ESO-1的CTL識別表位肽所制備得到的特異性CTL細胞免疫細胞群的流式細胞儀檢測數據的統計分析圖。

具體實施方式

下面，通過具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。

實施例1：合成表位肽

采用理論與實踐相結合的方法，根據抗原的一級結構，綜合運用免疫信息學手段，運用SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL、WAPP和EpiJen綜合對NY-ESO-1的抗原CTL表位進行預測分析，選取評分前20的多肽序列進行試驗篩選，依次命名為P1、P2、P3……P20。

基本流程如下：首先將一個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護基，第一個氨基酸即連接至固相載體上；其次將第二個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個氨基酸羧基再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重復上述的肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目的表位肽粗品。將目的表位肽粗品經HPLC純化得到目的表位肽精肽，其純度大于90％，質譜分析證實其分子量符合理論值。

本發明提出的一種特異性腫瘤抗原NY-ESO-1的CTL識別表位肽采用Fmoc固相合成法進行合成，所述CTL識別表位肽為十五肽，編號為P7，其氨基酸序列如下：Gly-Ala-Ala-Arg-Ala-Ser-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly-Ala-Pro-Arg-Gly。對P7進行質譜分析，其質譜分析結果如圖1所示，可以證實其分子量為1238.34g/mol，符合理論值。

實施例2：多肽功能檢測

上述所得P7和其余19個表位肽可用于制備具有NY-ESO-1表達的腫瘤治療性多肽疫苗，其應用實驗如下：

1、上述CTL識別表位肽誘導特異性CTL細胞、IFN-γ分泌及對腫瘤靶細胞的殺傷實驗檢測：抽取患者的外周血經密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加細胞因子培養DC細胞和CTL細胞，進一步采用DC細胞負載本發明的NY-ESO-1表位肽，與CTL共培養刺激特異的CTL擴增，進一步在體外采用ELISAPOT和LDH實驗檢測特異的CTL在特異抗原刺激下INF-γ的分泌及對黑色素瘤細胞A375的殺傷作用。

具體方法如下：

(I)、PBMC的分離與誘導：

1)將50mL抗凝處理的外周血，2000rpm離心10min；

2)收集上層血漿凍存，用PBS(pH＝7.4)稀釋剩下的血細胞；

3)將稀釋的血細胞加入到等體積的淋巴分離液液面上；

4)20℃離心20min，關閉離心機剎車；

5)離心后，分為四層，用吸嘴玻璃滴管吸取白膜層(即第二層)；

6)取出的白膜層用PBS洗滌兩遍；

7)將細胞以2～5×10⁶/mL接種到6孔板內，2h后，回收未貼壁的細胞，用預包被anti-CD3IgG和anti-CD28IgG的培養板進行激活培養；

8)貼壁的細胞加入GM-CSF和IL-4刺激培養5天誘導成DC細胞，第三天半換液；

9)第5天，收集DC細胞，將10μg實施例1所得目的表位肽精肽加入DC細胞中，1h后，將DC細胞與激活的T細胞共培養，同時加入IL2及IL-15；

10)繼續培養5天后，得到抗原特異的CTL細胞進行細胞因子分泌及對腫瘤細胞的殺傷實驗。

(II)、IFN-γ細胞因子分泌檢測：Human IFN-gamma Platinum ELISA(IFN-γELISA檢測試劑盒，eBioscience公司)檢測CTL細胞分泌的IFN-γ，步驟如下：

1)將CTL細胞去除細胞因子培養24h后，接種到96孔板內；

2)細胞中加入刺激對應的多肽再次刺激24h后，離心去除細胞，收集細胞上清；

3)采用ELISA檢測上清中IFN-γ的表達，選擇IFN-γ分泌較多的CTL表位肽進行殺傷實驗。

結果如圖2所示，P7和P3、P5負載的DC細胞均能夠較好誘導出特異性CTL細胞，分泌較高量的IFN-γ。

(III)、腫瘤細胞殺傷實驗：采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢測法，使用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(細胞毒性檢測試劑盒，Promega公司)進行LDH試驗檢測細胞殺傷能力。步驟如下：

1)設立檢測培養板(100μL/孔)

a.設立實驗組：以NY-ESO-1陽性表達的黑色素瘤細胞A375為靶細胞，按效應細胞和靶細胞比為5:1、10:1、20:1加入上述特性CTL細胞

b.設立效應細胞自發釋放組

c.設立靶細胞自發釋放組

d.設立靶細胞最大釋放組

e.設立背景對照組

2)細胞裂解及收獲上清

a.37℃5％CO₂共培養5h

b.靶細胞最大釋放組中加入裂解液，45min后，所有的孔，250g/min離心收集上清

3)LDH檢測

a.轉移50μL上清至另一個96孔板

b.每孔加入50μL稀釋的底物混合物，室溫避光孵育30min

c.每孔添加50μL終止液

d.在490nm下檢測吸光值OD

細胞殺傷率計算公式如下：

殺傷率(％)＝[(OD_實驗組-OD_{效應細胞自發釋放組}-OD_{靶細胞自發釋放組})/(OD_{靶細胞最大釋放組}-OD_{靶細胞自發釋放組})]×100％

結果如圖3所示，圖3為本發明實施例1所得P3、P5、P7各自誘導得到的特異性CTL細胞對黑色素瘤細胞A375殺傷能力對比圖；由圖3可知，P3和P7誘導的CTL細胞對黑色素瘤細胞A375均具有較好的殺傷效果。

2、采用流式分析獲得的特異CTL中各種免疫細胞所占的百分比，結果如圖4所示。由圖4可知，本發明由P7制備獲得的免疫細胞群中含有大量的CTL細胞，同時也含有一定比例的NKT細胞，即該免疫細胞群具有較好的免疫活性，具有強大的殺傷特定腫瘤細胞的能力。

以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。