本發明屬于植物培養基
技術領域：
，具體涉及一種紅景天細胞培養基。背景內容長鞭紅景天RhodiolafastigiataS.H.Fu為景天科(Crassulaceae)紅景天屬RhodiolaL.植物，其根及根莖主要含有紅景天苷等次生代謝產物，具有抗疲勞、抗衰老、抗缺氧、抗微波輻射及抗腫瘤等功效，是極具開發前景的環境適應藥物之一，亦是我國傳統名貴藥材珍品。由于受到需求遞增、生態環境日漸退化雙重因素的影響，紅景天野生資源正日益稀竭，部分物種幾近滅絕。紅景天組織培養經過了幾十年的研究雖有很大的進展，但還滿足不了紅景天的進一步開發利用的需要。獲得高產細胞系是實現長鞭紅景天大規模生產的前提，而細胞系的獲得往往需要一種細胞培養基。而目前對紅景天培養基的研究主要集中在愈傷組織的培養及芽誘導培養，如中國專利申請(CN101831398A)公布了一種添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基及制法和用途，技術方案為：向配制MS基本培養基的溶液中加入細胞分裂素BAP溶液和生長素NAA溶液，混合均勻，用無機酸或無機堿調節混合液的pH為5.6～5.8，高溫濕熱滅菌后加入經過濾除菌的二甲基亞砜，混合均勻，得到每升MS基本培養基中含有細胞分裂素BAP的濃度為1μmol·L-1～20μmol·L-1，生長素NAA的濃度為0.1μmol·L-1～5μmol·L-1，二甲基亞砜的濃度為0.001mL·L-1～20mL·L-1。中國專利申請(CN101773070A)公開了一種紅景天愈傷組織培養方法，它包括如下步驟：植物體的選擇及無菌處理、愈傷組織誘導培養和大規模培養三個環節，其核心技術是愈傷組織誘導培養，是在基本培養基MS添加蔗糖0-50g/L，瓊脂0-10g/L，α-萘乙酸0.1-5.0mg/L，6-芐氨基嘌呤0.1-5.0mg/L的基礎上，加入非生物誘導子硝普鈉SNP和硝酸銀。因此，目前亟需一種紅景天細胞培養基，為獲得高產紅景天細胞系提供基礎，有助于紅景天大規模培養和次級代謝物的大量生產。技術實現要素：為獲得紅景天高產細胞系，實現紅景天大規模培養和次級代謝物的大量生產，本發明提供了一種紅景天細胞培養基。本發明培養基能顯著提高紅景天細胞生物量和紅景天苷的積累量，并且培養基成分簡單，生產成本低，可達到產業化水平，能夠實現紅景天的大規模生產。本發明紅景天細胞培養基是通過以下技術方案實現的：一種紅景天細胞培養基，基礎培養基中主要添加由以下成分及其終濃度：蔗糖20-40g/L，6-芐氨基嘌呤1-5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.05-0.15mg/L，α-萘乙酸0.1-0.5mg/L，酪醇1-20mmol/L，硝酸銀10-80μmol/L，硝酸銨10-80μmol/L。優選地，基礎培養基中添加由以下成分及其終濃度：蔗糖32g/L，6-芐氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇12mmol/L，硝酸銀68μmol/L，硝酸銨32μmol/L。優選地，所述培養基初始pH為5.7-5.9。優選地，所述基礎培養為MS培養基或B5培養基。優選地，所述紅景天細胞培養基適用于細胞懸浮培養體系。本發明紅景天細胞培養基根據紅景天細胞生長特性，經過大量實驗篩選得到本發明培養基組成成分及其濃度。碳源的形式和質量濃度對愈傷組織細胞的生長和次生代謝產物的量有明顯影響，一般采用蔗糖、果糖和葡萄糖作為碳源。本發明技術人員選擇了蔗糖作為紅景天細胞生長所需的碳源，確定了蔗糖濃度的使用范圍，并篩選得到了最佳的使用濃度為32g/L。激素是調節植物細胞生長發育和代謝產物形成的主要物質，在本發明培養基中，6-芐氨基嘌呤，2,4-二氯苯氧乙酸和α-萘乙酸相互作用，并在相應的濃度范圍內能夠起到促進紅景天細胞生長和紅景天苷等次級代謝物的產生。本發明技術人員發現，在細胞培養基中加入酪醇能夠促進紅景天苷的形成。經過實驗證明當初始培養基中酪醇濃度為1-20mmol/L時，促進紅景天苷形成效果明顯，其中酪醇濃度為12mmol/L時效果最佳。氮元素不僅是植物細胞的重要組成元素，也是一些次級代謝產物的組成元素，如生物堿。雖然，紅景天苷中不直接含有N元素，但因其為苯丙氨酸的衍生物，故氮素供應的形式以及作用質量濃度從理論上講都可以影響紅景天苷的代謝。NH4+/NO3-的比值和量與植物細胞生長和次生代謝累積關系密切，本發明技術人員發現，當細胞培養基中NH4+/NO3-比值為1:2.5時，對紅景天苷的合成促進作用最大。本發明紅景天細胞培養基與現有培養基相比，具有以下優勢：(1)本發明培養基中培養得到的紅景天細胞生物量是對比例培養基中的2.5倍，紅景天苷的積累量是對比例培養基中的3.6倍，本發明紅景天細胞培養基對紅景天細胞生長和次級代謝物的積累具有突出的作用效果。(2)本發明紅景天細胞培養基成分簡單，生產成本低，可達到產業化水平，能夠實現紅景天的大規模生產。附圖說明圖1：實施例1-3及對比例1-3培養基中紅景天細胞的生物量比較。圖2：實施例1-3及對比例1-3培養基培養得到的愈傷組織顆粒中紅景天苷的含量的比較。具體實施方式以下通過具體實施方式的描述對本發明作進一步說明，但這并非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。實施例1一種紅景天細胞培養基一種紅景天細胞培養基，其向基礎培養基MS中添以下成分及其終濃度：蔗糖32g/L，6-芐氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇12mmol/L，硝酸銀48μmol/L，硝酸銨32μmol/L。紅景天細胞培養基的制備方法：稱取相應質量的蔗糖，6-芐氨基嘌呤，2,4-二氯苯氧乙酸，α-萘乙酸，酪醇，硝酸銀，硝酸銨依次加入到MS培養基中，攪拌均勻，將pH調整至5.8，120℃滅菌20min，即得。實施例2一種紅景天細胞培養基一種紅景天細胞培養基，其向基礎培養基MS中添以下成分及其終濃度：蔗糖20g/L，6-芐氨基嘌呤1mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L，α-萘乙酸0.1mg/L，酪醇1mmol/L，硝酸銀10μmol/L，硝酸銨10μmol/L。制備方法與實施例1類似。實施例3一種紅景天細胞培養基一種紅景天細胞培養基，其向基礎培養基B5中添以下成分及其終濃度：蔗糖40g/L，6-芐氨基嘌呤5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.15mg/L，α-萘乙酸0.5mg/L，酪醇20mmol/L，硝酸銀80μmol/L，硝酸銨80μmol/L。制備方法與實施例1類似。對比例1一種紅景天細胞培養基一種紅景天細胞培養基，其向基礎培養基MS中添以下成分及其終濃度：蔗糖50g/L，6-芐氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇12mmol/L，硝酸銀48μmol/L，硝酸銨32μmol/L。制備方法與實施例1類似。與實施例1的區別在于，培養基中蔗糖濃度為50g/L。對比例2一種紅景天細胞培養基一種紅景天細胞培養基，其向基礎培養基MS中添以下成分及其終濃度：蔗糖32g/L，6-芐氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇24mmol/L，硝酸銀48μmol/L，硝酸銨32μmol/L。制備方法與實施例1類似。與實施例1的區別在于，培養基中酪醇濃度為24mmol/L。對比例3一種紅景天細胞培養基一種紅景天細胞培養基，其向基礎培養基MS中添以下成分及其終濃度：蔗糖32g/L，6-芐氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇12mmol/L，硝酸銀32μmol/L，硝酸銨32μmol/L。制備方法與實施例1類似。與實施例1的區別在于，培養基中NH4+/NO3-比例為1:2。試驗例1細胞生物量的測定以長鞭紅景天實生苗幼莖作為外植體誘導產生愈傷組織，生長旺盛的愈傷組織繼代培養20天分別加入實施例1-3、對比例1-3制備得到的培養基中，建立細胞懸浮培養體系。細胞懸浮培養系每隔10天繼代1次。培養基初始pH為5.8。培養室內光周期為14h/d，培養溫度為24℃，搖床轉速為110r/min。將上述試驗例1收獲得到的各小細胞團分別用5倍體積的蒸餾水充分洗滌3次，抽干表面水分，稱其鮮質量，后于60℃烘箱中烘至恒質量，放入干燥器內冷卻，稱其干質量。具體結果如表1所示。表1不同培養基中細胞生物量的變化培養基細胞生物量(g/L)實施例132.5±1.25實施例228±0.89實施例327±0.65對比例113±1.22對比例215±0.37對比例320±0.87由表1可知，利用實施例培養基得到的紅景天細胞量明顯高于對比例培養基，其中實施例1培養基中得到的細胞生物量是對比例1中的2.5倍。由此可知，本發明紅景天細胞培養基能明顯促進紅景天細胞的生長。各培養基中細胞生物量的比較如圖1所示。試驗例2紅景天苷的提取及測定將各培養基培養得到的長鞭紅景天愈傷組織顆粒65℃烘干至恒質量，粉碎(過40目篩)，75％乙醇浸提12h，后于90℃水浴中回流提取40min，加入5倍紅景天體積75％乙醇。提取液用4層紗布濾過。濾液減壓蒸餾(70℃，7kPa)除去大部分乙醇，上AB-8樹脂柱，20％乙醇洗脫，洗脫體積流量為5mL/min，收集洗脫液再經二次減壓蒸餾(70℃，7kPa)除去大部分乙醇，冷凍干燥，得淺棕色固體，待用。HPLC法測定紅景天苷量，結果如表2所示。表2不同培養基愈傷組織中紅景天苷的含量培養基紅景天苷的含量(紅景天苷量/細胞干質量mg/g)實施例123.4±0.39實施例219.7±0.57實施例317.2±0.91對比例16.5±0.43對比例28.6±0.64對比例37.8±0.32由表2可知，利用實施例培養基得到的組織中紅景天苷含量明顯高于對比例培養基，其中實施例1培養基中得到的是對比例1中的3.6倍。由此可知，本發明紅景天細胞培養基能明顯促進紅景天細胞中次級代謝物紅景天苷的生成。各培養基愈傷組織中紅景天苷的含量比較如圖2所示。當前第1頁1 2 3