一種藥物靶點預測和藥物全方面評價方法與流程

本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種基于單細胞或少量細胞轉錄組測序方法的藥物發現與評價，靶點預測及用藥指導方法。
背景技術：
：目前世界上常用的藥物篩選和評價體系主要分為高通量篩選和高內涵篩選。其中經典的高通量篩選主要是在制藥及生物產業中采用機器人及計算機實現全自動化的生物及藥理學實驗，從而對大量未知化合物進行迅速評估，以發現具備生物學活性的潛在候選藥物。然而，由于高通量篩選技術本身的局限性使得其非常依賴于高度靈敏性的單一報告體系，使得通過高通量篩選雖然可以在短時間內完成大量未知化合物的測試，但這種篩選量上的提高并沒有使得預期新藥的發現量有所增加。相反，在大規模應用高通量篩選技術后，整個制藥行業的產能在過去的幾十年中出現了下降的趨勢。并且由于高通量篩選技術依賴于高度靈敏性的單一報告體系，對于復雜的生命系統而言高通量篩選結果無法準確而全面反映藥物在生命系統中作用的真實性。這使得提高藥物篩選的效率和質量成為勢在必行的途徑，盡管這樣會增加前期投入成本，但是會減少很多不必要的潛在藥物流失。隨著成像技術的發展及在生物學上的應用，結合成像系統及高通量篩選系統就誕生了一種更先進的藥物篩選和評價體系，即高內涵篩選系統。通過對多重報告體系的定量監測及精確到亞細胞結構的表型變化觀測，對于藥物在生命系統中的作用，高內涵篩選系統在更多的維度上提供了比高通量篩選單一報告體系更全面的評價指標。隨著技術的開發及更多維度的觀測指標的發現，高內涵篩選系統可以實現更加準確而全面反映藥物在生命系統中的真實性作用。然而其代價是大大增加篩選系統的復雜性及前期藥物篩選成本。因此現在的藥物篩選的主流趨勢是先利用高通量篩選系統發現具備生物學活性的潛在候選藥物，然后利用高內涵篩選系統對高通量篩選系統得到的潛在候選藥物進行多維度的評價。雖然高內涵系統可以從多維度評價潛在的候選藥物，但是其評價指標覆蓋面仍然很難達到理想的效果。人們更多的還是希望獲得一種全方面評價藥物效果的測試方法。技術實現要素：本發明的一個目的是提供一種藥物靶點預測或藥物評價方法，所述方法包括：檢測和分析細胞中全基因組rna的表達水平。所述細胞包括待測藥物處理后的細胞、正常細胞和/或非正常細胞；具體可為待測藥物處理后的肝癌細胞；再具體可為待測藥物處理后的hepg2肝癌細胞。所述方法還包括在檢測和分析細胞中全基因組rna的表達水平前，先對待測藥物處理后的細胞、正常細胞和/或非正常細胞構建多標簽全轉錄組測序文庫；所述細胞具體可為肝癌細胞；再具體可為hepg2肝癌細胞。所述方法還包括在構建多標簽全轉錄組測序文庫前，可進行待測藥物有效性和/或基本毒理學評價，具體的可進行細胞凋亡檢測分析和/或細胞周期阻滯檢測分析。所述方法還包括在進行待測藥物有效性和/或基本毒理學評價前，可先進行細胞系的培養和傳代；所述細胞系具體可為肝癌細胞系；再具體可為hepg2肝癌細胞系。本發明的另一個目的是提供一種多標簽全轉錄組測序文庫的構建方法，所述方法包括：1)在含有不同標簽序列的rt引物裂解液中分別裂解細胞釋放rna分子，使rna分子變性，進行逆轉錄反應，在逆轉錄反應結束后進行預擴增反應；2)將步驟1)所得所有預擴增反應產物混合后純化，純化之后進行第二輪擴增；3)第二輪擴增的產物純化之后，利用超聲破碎產物，富集3’末端產物，進行文庫構建。所述方法中，步驟1)所述細胞，可為單個或多個細胞；具體的，可為單個細胞；具體的，所述多個細胞為不超過500個細胞。所述方法中，步驟1)所述細胞，包括待測藥物處理后的細胞、正常細胞和/或非正常細胞；具體可為待測藥物處理后的肝癌細胞；再具體可為待測藥物處理后的hepg2肝癌細胞。所述方法的具體操作過程包括：(1)配制2.5ul的裂解液在無rna酶的干凈的96孔板中，每個孔中依次加入含有不同標簽序列1-96號的rt引物，引物濃度可以是100nm到1um。上述2.5ul的裂解液的體系為：用無核酸酶的水補齊到2.5ul上述rt引物的組成結構如下：5’tcagacgtgtgctcttccgatctxxxxxxxxnnnnnnnnttttttttttttttttttttttttt上述rt引物中，x序列為標簽序列，本實施例共設計了96個標簽序列，用于區分同一文庫中不同的細胞；n序列為隨機的未定義的分子標記(uniquemolecularidentifier)序列，可以用來計算每個基因的轉錄本拷貝數。96個標簽序列的具體核苷酸序列為：序號標簽序列序號標簽序列序號標簽序列序號標簽序列1aacgtgat25agatcgca49gatagaca73aatgttgc2aaacatcg26agcaggaa50gccacata74acacgacc3atgcctaa27agtcacta51gcgagtaa75acagattc4agtggtca28atcctgta52gctaacga76agatgtac5accactgt29attgagga53gctcggta77agcacctc6acattggc30caaccaca54ggagaaca78agccatgc7cagatctg31caagacta55ggtgcgaa79aggctaac8catcaagt32caatggaa56gtacgcaa80atagcgac9cgctgatc33cacttcga57gtcgtaga81atcattcc10acaagcta34cagcgtta58gtctgtca82attggctc11ctgtagcc35cataccaa59gtgttcta83caaggagc12agtacaag36ccagttca60taggatga84caccttac13aacaacca37ccgaagta61tatcagca85ccatcctc14aaccgaga38ccgtgaga62tccgtcta86ccgacaac15aacgctta39cctcctga63tcttcaca87cctaatcc16aagacgga40cgaactta64tgaagaga88cctctatc17aaggtaca41cgactgga65tggaacaa89cgacacac18acacagaa42cgcataca66tggcttca90cggattgc19acagcaga43ctcaatga67tggtggta91ctaaggtc20acctccaa44ctgagcca68ttcacgca92gaacaggc21acgctcga45ctggcata69aactcacc93gacagtgc22acgtatca46gaatctga70aagagatc94gagttagc23actatgca47gactagta71aaggacac95gatgaatc24agagtcaa48gagctgaa72aatccgtc96gccaagac(2)當把藥物處理之后的細胞手動挑取到步驟(1)所述的裂解液)(每管裂解液挑入細胞不超過500個)之后，迅速劇烈震蕩并離心，在pcr儀器上進行72℃3分鐘裂解細胞釋放rna分子并使其變性。然后加入2.85ul的逆轉錄反應液體系，迅速混勻離心，放在pcr儀上進行逆轉錄反應，具體溫度程序為：25℃5分鐘；42℃60分鐘；50℃30分鐘；72℃10分鐘失活逆轉錄酶。上述2.85ul逆轉錄反應液體系為：用無核酸酶的水補齊到2.85ul上述tso引物的核苷酸序列為：5’aagcagtggtatcaacgcagagtacatrgrg+g，lna修飾(3)在逆轉錄反應結束后緊接著做預擴增反應，在上述步驟(2)的反應體系中加入7.5ul的擴增混合液，預擴增分為兩步：先是4個循環的98℃20秒,65℃30秒,72℃5分鐘；然后是8-12個循環(本實施例具體是8個循環)的98℃20秒,67℃15秒,72℃5分鐘。擴增結束后直接將一個96孔板的所有反應產物轉移到一個管子中，純化之后進行第二輪擴增。上述7.5ul的擴增混合液體系為：2xkapahifihotstartreadymix(貨號為kk2602)6.5ul10umispcr引物0.25ul10um3’p2引物0.75ul用無核酸酶的水補齊到7.5ul引物濃度可以在200nm到1um。上述ispcr引物的核苷酸序列如下：5’aagcagtggtatcaacgcagagt上述3’p2引物的核苷酸序列如下：5’gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc(4)經過4-5個循環的二輪擴增(本實施例具體是4個循環)，具體擴增的程序為98℃20秒,67℃15秒,72℃5分鐘。擴增產物純化之后，利用超聲破碎到250至500個堿基長度不等，這樣物理地隨機打斷比酶切破碎產生的dna斷裂位置更隨機。打斷后每個文庫用10ulinvitrogen的c1磁珠(貨號65002)孵育，富集出轉錄本的3’末端。后續用kapa的建庫試劑盒(貨號kk8506)進行文庫構建。上述二輪擴增的擴增反應體系為：用無核酸酶的水補齊到50ul。上述cdna模板總量可以是1ng到100ng不等，引物濃度可以是300nm到600nm不等。上述biotin-index引物的組成結構如下：5’/biotin/caagcagaagacggcatacgagatindexgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc其中index對應的為6個堿基序列，可以多樣化，本實施例具體的index核苷酸序列為：gtagag。上述ispcr引物的核苷酸序列如下：5’aagcagtggtatcaacgcagagt(與步驟3中的一樣)本發明的還一個目的是提供一種多標簽全轉錄組測序文庫，所述文庫是通過上述多標簽全轉錄組測序文庫的構建方法構建獲得的。本發明的還一個目的是提供多標簽全轉錄組測序文庫在藥物靶點發現、預測、各藥物相互關系、藥物作用機理研究、藥物新用途的發現和/或藥物評價中的應用。所述多標簽全轉錄組測序文庫為上述的多標簽全轉錄組測序文庫和/或通過上述多標簽全轉錄組測序文庫的構建方法所構建的多標簽全轉錄組測序文庫。本發明的還一個目的是提供多標簽全轉錄組測序文庫在制備藥物靶點發現、預測、不同藥物相互關系、藥物作用機理研究、藥物新用途的發現和/或藥物潛在安全風險性評價產品中的應用。所述產品可為試劑盒。本發明的還一個目的是提供靶點hagh、sdhaf4、ldha和/或elf3在制備治療與靶點hagh、sdhaf4、ldha和/或elf3有關的疾病的藥物中的應用。具體的靶向肝癌細胞殺傷作用的靶向藥物中的應用。本發明的還一個目的是提供r428或sorafenib或crizotinib在制備治療與靶點hagh、sdhaf4、ldha和/或elf3有關的疾病的藥物中的應用。本發明的還一個目的是提供sunitinib、r428和/或crizotinib在制備治療肝癌的藥物中的應用。本發明的再一個目的是提供r428在制備治療與細胞周期相關調控網絡相關疾病藥物中的應用，所述疾病不包括與細胞周期相關調控網絡相關的白血病；sorafenib在制備治療與蛋白質及大分子功能網絡相關疾病藥物中的應用，所述疾病不包括與蛋白質及大分子功能網絡相關的肝癌、腎癌；crizotinib在制備治療與糖類及碳水化合物代謝網絡相關疾病藥物中的應用，所述疾病不包括與糖類及碳水化合物代謝網絡相關的肺癌和淋巴癌；sunitinib在制備治療與細胞凋亡相關疾病藥物中的應用，所述疾病不包括與細胞凋亡相關的晚期腎細胞癌、胃腸間質瘤和胰腺神經內分泌瘤。本發明提供的藥物靶點預測或藥物評價方法是一種全方面評價藥物效果的測試方法，添補了目前藥物全方面評價方法的空白。本發明提供的一種多標簽全轉錄組測序文庫的構建方法和該方法所構建的一種多標簽全轉錄組測序文庫，所構建的文庫反映了作為生命系統基本單位的細胞在不同狀態下的生理活動，進而準確而全面反映藥物在生命系統中作用的真實性，其精確度和維度覆蓋面是目前所有藥物評價體系難以企及的。本發明提供的藥物靶點預測或藥物評價方法和本發明提供的一種多標簽全轉錄組測序文庫的構建方法和該方法所構建的一種多標簽全轉錄組測序文庫，適用于單細胞或少量細胞，成本低，對樣本需求量小，可實現對藥物在生命系統中作用的高通量準確評價，是新一代高精度及高維度藥物篩選和評價體系，可對藥物作用機理進行全面系統研究，可對不同藥物間潛在組合效應及可能的新藥研發靶點進行預測，從而指導新藥研發及臨床給藥。附圖說明圖1為細胞凋亡分析結果圖。圖2為細胞周期分析結果圖。圖3為多標簽的全轉錄組測序文庫構建示意圖。圖4為多標簽全轉錄組測序文庫的評價結果圖。圖5為待測藥物作用72h的hepg2基因表達聚類分析情況圖。圖6為待測藥物作用72h的hepg2基因表達spantree分析情況圖。圖7為對肝癌細胞hepg2有殺傷作用的靶向藥物的共同抑制基因分析圖。圖8為新的藥物作用代表性靶基因ldha的表達情況隨三種藥物作用濃度的變化趨勢圖。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、多標簽的全轉錄組測序文庫的構建(一)細胞培養1.hepg2肝癌細胞系的培養和傳代(1)將hepg2肝癌細胞系置于含10％fbs的dmem-hg培養基下培養至接近80％密度。(2)用pbs緩沖液洗2遍，以除去上層死細胞，加入適量trypsin于37℃消化3分鐘，之后用10％fbs的dmem-hg培養基進行中和，離心并去除上清。(3)用10％fbs的dmem-hg培養基進行重懸，計數并傳代，傳代比例1：6.2.在hepg2肝癌細胞系上對fda批準靶向藥物的有效性進行測試(1)將hepg2肝癌細胞系置于含10％fbs的dmem-hg培養基下培養至接近80％密度。(2)用pbs緩沖液洗2遍，以除去上層死細胞，加入適量trypsin于37℃消化3分鐘，之后用10％fbs的dmem-hg培養基進行中和，離心并去除上清。(3)用10％fbs的dmem-hg培養基進行重懸，計數并傳代，傳代密度：1.0x10^5/孔。(4)待測藥物準備：將藥物稀釋到合適的濃度，一般濃儲為10mm。測試濃度設置為1000x，5000x，10000x。(5)傳代24小時后，待細胞匯合度達到60％左右加入待測藥物。每個濃度設3個平行孔。(6)分別于加入藥物后24h，48h，72h觀察細胞狀態，拍照記錄，并于72h收樣進行毒理學檢測及下述步驟(三)的多標簽的全轉錄組測序。本實施例所用fda批準的靶向藥物具體信息如表1所示。表1(二)藥物基本毒理學評價1.細胞凋亡檢測(1)將每個待測孔的細胞用pbs緩沖液洗2遍，以除去上層死細胞，加入適量trypsin于37℃消化3分鐘，之后用10％fbs的dmem-hg培養基進行中和，離心并去除上清。之后用pbs清洗2次；(2)利用流式細胞儀(bdfacscalibur)：對細胞進行凋亡分析。分析結果如圖1所示，縱坐標為第72h凋亡細胞占總細胞的比例。橫坐標ck為未處理組。可見#3sorafenib(靶向erk)作為已知具有靶向肝癌細胞的藥物。其對hepg2肝癌細胞的殺傷作用隨著濃度的增加而增強。而#4ibrutinib，#8nilotinib，和#11dasatinib作為白血病特征靶點(btk和abl)靶向藥對肝癌細胞hepg2無殺傷作用。有趣的是同#3sorafenib作用靶點相近的#5crizotinib(靶點為c-met)和#7sunitinib(靶點為rtk)盡管不是作為肝癌的靶向藥，在本研究中也可以有效殺傷hepg2肝癌細胞。此外，我們還觀察到#2r428(靶點為axl)在低濃度組(10000x)即可在短時間(24h)完全殺傷肝癌細胞hepg2。結果未展示。2.細胞周期阻滯檢測(1)將每個待測孔的細胞用pbs緩沖液洗2遍，以除去上層死細胞，加入適量trypsin于37℃消化3分鐘，之后用10％fbs的dmem-hg培養基進行中和，離心并去上除上清。之后用pbs清洗2次；(2)利用流式細胞儀(bdfacscalibur)：對細胞進行周期分析，分析結果如圖2所示，縱坐標為處于不同細胞周期的細胞所占細胞總數的百分比。橫坐標ck為未處理組。可見#3sorafenib(靶向erk)作為已知具有靶向肝癌細胞的藥物。其對hepg2肝癌細胞的細胞周期的影響主要是使其阻滯在g2/m期，其它對肝癌細胞hepg2有殺傷作用的靶向藥#2r428(靶點為axl)，#5crizotinib(靶點為c-met)和#7sunitinib(靶點為rtk)則分別會使hepg2阻滯在g0/g1期和g2/m期。對肝癌細胞hepg2沒有明顯抑制作用的#8nilotinib(靶點為abl)則同未處理組一樣對細胞周期沒有顯著影響。(三)多標簽的全轉錄組測序文庫的構建1.細胞收樣及文庫構建多標簽的全轉錄組測序文庫構建的示意圖如圖3所示，將處于不同生命生理狀態的細胞(同樣狀態的細胞可一個或多個)利用手工操作分別依次轉移到包含有不同標簽序列的rt引物的裂解液中。為了提高反轉錄步驟的效率并保證標簽序列的引入不會影響數據質量，我們嚴格控制反轉錄引物中標簽序列的長度，設計了總共96組標簽序列。接下來分別對每個樣本獨立進行逆轉錄和預擴增。預擴增完后的產物直接混合到一起，純化之后得到的cdna模板用ispcr引物和biotin-index引物進行二次擴增。擴增產物通過純化去除引物二聚體之后進行超聲打碎，利用帶有鏈霉親和素修飾的磁珠富集cdna產物的一端后在磁珠上進行單端index建庫流程。具體操作過程如下所述：(1)配制2.5ul的裂解液在無rna酶的干凈的96孔板中，每個孔中依次加入含有不同標簽序列1-96號的rt引物，引物濃度可以是100nm到1um。上述2.5ul的裂解液的體系為：用無核酸酶的水補齊到2.5ul上述rt引物的組成結構如下：5’tcagacgtgtgctcttccgatctxxxxxxxxnnnnnnnnttttttttttttttttttttttttt上述rt引物中，x序列為標簽序列，本實施例共設計了96個標簽序列，用于區分同一文庫中不同的細胞；n序列為隨機的未定義的分子標記(uniquemolecularidentifier)序列，可以用來計算每個基因的轉錄本拷貝數。96個標簽序列的具體核苷酸序列及編號見表2：表2序號標簽序列序號標簽序列序號標簽序列序號標簽序列1aacgtgat25agatcgca49gatagaca73aatgttgc2aaacatcg26agcaggaa50gccacata74acacgacc3atgcctaa27agtcacta51gcgagtaa75acagattc4agtggtca28atcctgta52gctaacga76agatgtac5accactgt29attgagga53gctcggta77agcacctc6acattggc30caaccaca54ggagaaca78agccatgc7cagatctg31caagacta55ggtgcgaa79aggctaac8catcaagt32caatggaa56gtacgcaa80atagcgac9cgctgatc33cacttcga57gtcgtaga81atcattcc10acaagcta34cagcgtta58gtctgtca82attggctc11ctgtagcc35cataccaa59gtgttcta83caaggagc12agtacaag36ccagttca60taggatga84caccttac13aacaacca37ccgaagta61tatcagca85ccatcctc14aaccgaga38ccgtgaga62tccgtcta86ccgacaac15aacgctta39cctcctga63tcttcaca87cctaatcc16aagacgga40cgaactta64tgaagaga88cctctatc17aaggtaca41cgactgga65tggaacaa89cgacacac18acacagaa42cgcataca66tggcttca90cggattgc19acagcaga43ctcaatga67tggtggta91ctaaggtc20acctccaa44ctgagcca68ttcacgca92gaacaggc21acgctcga45ctggcata69aactcacc93gacagtgc22acgtatca46gaatctga70aagagatc94gagttagc23actatgca47gactagta71aaggacac95gatgaatc24agagtcaa48gagctgaa72aatccgtc96gccaagac(2)將上述步驟(一)中經不同藥物及不同藥物濃度處理的細胞(同一藥物同一濃度處理的細胞可以是單個細胞或者多個)利用手工操作分別依次轉移到(1)所述包含有不同標簽序列的rt引物的裂解液中(每管裂解液挑入細胞不超過500個)之后，迅速劇烈震蕩并離心，在pcr儀器上進行72℃3分鐘裂解細胞釋放rna分子并使其變性。然后加入2.85ul的逆轉錄反應液體系，迅速混勻離心，放在pcr儀上進行逆轉錄反應，具體溫度程序為：25℃5分鐘；42℃60分鐘；50℃30分鐘；72℃10分鐘失活逆轉錄酶。上述2.85ul逆轉錄反應液體系為：用無核酸酶的水補齊到2.85ul上述tso引物的核苷酸序列為：5’aagcagtggtatcaacgcagagtacatrgrg+g，lna修飾(3)在逆轉錄反應結束后緊接著做預擴增反應，在上述步驟(2)的反應體系中加入7.5ul的擴增混合液，預擴增分為兩步：先是4個循環的98℃20秒,65℃30秒,72℃5分鐘；然后是8-12個循環(本實施例具體是8個循環)的98℃20秒,67℃15秒,72℃5分鐘。擴增結束后直接將一個96孔板的所有反應產物轉移到一個管子中，純化之后進行第二輪擴增。上述7.5ul的擴增混合液體系為：2xkapahifihotstartreadymix(貨號為kk2602)6.5ul10umispcr引物0.25ul10um3’p2引物0.75ul用無核酸酶的水補齊到7.5ul引物濃度可以在200nm到1um。上述ispcr引物的核苷酸序列如下：5’aagcagtggtatcaacgcagagt上述3’p2引物的核苷酸序列如下：5’gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc(4)經過4-5個循環的二輪擴增(本實施例具體是4個循環)，具體擴增的程序為98℃20秒,67℃15秒,72℃5分鐘。擴增產物純化之后，利用超聲破碎到250至500個堿基長度不等，這樣物理地隨機打斷比酶切破碎產生的dna斷裂位置更隨機。打斷后每個文庫用10ulinvitrogen的c1磁珠(貨號65002)孵育，富集出轉錄本的3’末端。后續用kapa的建庫試劑盒(貨號kk8506)進行文庫構建。上述二輪擴增的擴增反應體系為：用無核酸酶的水補齊到50ul。上述cdna模板總量可以是1ng到100ng不等，引物濃度可以是300nm到600nm不等。上述biotin-index引物的組成結構如下：5’/biotin/caagcagaagacggcatacgagatindexgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc其中index對應的為6個堿基序列，可以多樣化，本實施例具體的index核苷酸序列為：gtagag。上述ispcr引物的核苷酸序列如下：5’aagcagtggtatcaacgcagagt(與步驟3中的一樣)2.對所構建的多標簽全轉錄組測序文庫的評價結果如圖4所示，其中，圖a1-a4分別依次為本實施例所構建的多標簽全轉錄組測序文庫的片段分布、gc含量、文庫數據的錯誤率、文庫數據堿基平均質量值；圖b1-b4為普通文庫(即用普通smartseq2方法構建的單細胞文庫)的片段分布、gc含量、文庫數據的錯誤率、文庫數據堿基平均質量值。由于本發明所構建的多標簽全轉錄組測序文庫read2端(具體為上述步驟1中的biotin-index引物一端)堿基存在高度一致性，所以數據的質量值比普通文庫低，同時錯誤率比普通文庫高，但是主要用于下述實施例2所述分析的read1端(和含有biotin-index引物端相反的另外一端)得到的序列的錯誤率和質量值與普通文庫沒有差異，本發明所構建的多標簽全轉錄組測序文庫可進一步用于下述實施例2的測序及結果分析。實施例2、多標簽全轉錄組測序文庫的測序及結果分析(一)將實施例1所構建的文庫在illumina測序平臺進行雙端測序。(二)對上述測序結果進行分析:1、測序結果的聚類分析圖5為待測藥物作用72h的hepg2基因表達聚類分析情況，可以看出對肝癌細胞hepg2有殺傷作用的靶向藥藥物#2r428(靶點為axl)，#5crizotinib(靶點為c-met)具有相似的表達特征。而與#7sunitinib(靶點為rtk)及已知具有靶向肝癌細胞的藥物#3sorafenib(靶向erk)不同，說明它們對肝癌細胞hepg2殺傷作用的機理不同。2、測序結果的spantree分析圖6為待測藥物作用72h的hepg2基因表達spantree分析情況，可以看出對肝癌細胞hepg2有殺傷作用的靶向藥藥物#2r428(靶點為axl)，#5crizotinib(靶點為c-met)具有相近的關系。已知具有靶向肝癌細胞的藥物#3sorafenib(靶向erk)的關系較為獨立。而另一個對肝癌細胞hepg2有殺傷作用的靶向藥藥物#7sunitinib(靶點為rtk)則介于二者之間。圖6中drug2為藥物#2r428(靶點為axl)，drug3為藥物#3sorafenib(靶向erk)，drug5為藥物#5crizotinib(靶點為c-met)，drug7為藥物#7sunitinib(靶點為rtk)。3、測序結果的go分析表3-表6為對肝癌細胞hepg2有殺傷作用的靶向藥物抑制基因的go分析。由表3可知已知具有靶向肝癌細胞的藥物#3sorafenib(靶向erk)主要作用在蛋白質及大分子功能網絡。由表4可知#2r428(靶點為axl)主要作用在細胞周期相關調控網絡。由表5可知#5crizotinib(靶點為c-met)主要作用在糖類及碳水化合物代謝網絡。由由表6可知#7sunitinib(靶點為rtk)主要影響細胞凋亡。表3表4表5表64、對肝癌細胞hepg2有殺傷作用的靶向藥物的共同抑制基因分析及對肝癌細胞hepg2有殺傷作用的新的藥物作用靶點預測圖7為對肝癌細胞hepg2有殺傷作用的靶向藥物的共同抑制基因分析。由圖7可以看出三種藥物的共同靶點包括sprssa、lxn、bnip3、gatb、hagh、sdhaf4、ldha、elf3、urb1-as1、ccdc125。其中粗體表示的基因為預測得到的首選新的藥物作用靶點,分別為hagh、sdhaf4、ldha、elf3。圖7中drug2為藥物#2r428(靶點為axl)，drug3為藥物#3sorafenib(靶向erk)，drug5為藥物#5crizotinib(靶點為c-met)。5、新的藥物作用代表性靶基因ldha的表達情況隨三種藥物作用濃度的變化趨勢圖8為新的藥物作用代表性靶基因ldha的表達情況隨三種藥物作用濃度的變化趨勢(處理72h)。由圖8可以看出預測的到的新靶點ldha的表達水平隨著對肝癌細胞hepg2有殺傷作用的靶向藥物的濃度升高而逐漸降低。圖8中drug2為藥物#2r428(靶點為axl)，drug3為藥物#3sorafenib(靶向erk)，drug5為藥物#5crizotinib(靶點為c-met)。當前第1頁12