用褐藻糖膠和多酚制備具有抗菌活性的可食性膜的方法與流程

本發明屬于可食性膜領域，具體是一種用褐藻糖膠和多酚制備具有抗菌活性的可食性膜的方法。

背景技術：

食品周圍的微生物和食品氧化是食品變質的重要原因，難以降解的包裝材料如聚乙烯、聚丙烯對環境和被包裝食品都有較大危害，而可食性抗菌膜以天然可食性物質(如蛋白質、多糖、脂類等)為原料，添加可食用的增塑劑、交聯劑等，通過分子間的相互作用而形成的具有多孔網絡結構的膜，能防止氣體、水汽和溶質等的遷移，保持食品質量，延長食品貨架期，而且可食性膜具有綠色環保、生物降解、無毒無害、本身有營養價值引起了人們的關注。

將抗菌劑融合進可食性膜，按一定規律緩慢釋放，在較長時間內逐漸作用于食品，也能減少使用防腐劑，從而持久的抑制或防止腐敗菌群和減少病原體的增長，達到抗菌作用。

褐藻糖膠主要成分是L-巖藻糖-4-硫酸酯的酸性雜多糖，溶于水，不溶于乙醇和氯仿等有機溶劑，可從海帶、羊棲菜和裙帶菜等主要褐藻中提取，中國是褐藻生產大國，如海帶產量約占世界總產量的95%，羊棲萊也有大規模人工養殖，文獻報道褐藻糖膠在海帶和羊棲菜中提取率7.3%和4.6%；可利用浙江沿海盛產的海帶和羊棲菜下腳料來提取褐藻糖膠增加褐藻的附加值，提取褐藻糖膠方法較為成熟。

羊棲菜屬褐藻門馬尾藻屬，在中國各海域都能生長來源豐富，并建有大型的人工養殖基地，具有抗血栓、降血脂和延緩衰老等功效。而酚類化合物廣泛存在于褐藻中，具有多種營養保健功能，酚類化合物具有很強的抗菌功能，研究表明褐藻多酚具有很強的自由基清除能力。多酚在包裝膜上的和抗菌能力取決于多酚從膜基質的遷移能力。由此可見，羊棲菜來源豐富，羊棲菜內的多酚含量高，提取的多酚具有對人體無害、有較高的抗菌能力。如果能融合進褐藻糖膠基質制備成膜將有可能成為具有抗菌功能的可食性活性膜。目前，國內外尚未有褐藻糖膠作為基質制備具有抗菌活性的可食性膜的報道，因此限制了褐藻糖膠的應用領域和應用價值，有必要對此進行改進。

技術實現要素：

本發明的目的是為了克服現有技術存在的缺點和不足，而提供一種低能耗、操作簡單、綠色環保等優點，且提高褐藻糖膠的應用領域和應用價值的用褐藻糖膠和多酚制備具有抗菌活性的可食性膜的方法。

為實現上述目的，本發明的技術方案是包括以下步驟：

（1）褐藻糖膠和多酚復合膜液，該膜液包括以下組分：

褐藻糖膠 1wt%

甘油 0.08-0.64wt%

吐溫-80 0.16-0.80wt%

多酚 0.12-0.44wt%

余量為水；

（2）去除褐藻糖膠和多酚復合膜液中的氣泡；

（3）制備坯膜：將褐藻糖膠和多酚復合膜液倒入到成膜模具中，凝固成坯膜；

（4）對坯膜烘干，去除水分；

（5）交聯固定：坯膜連同成膜模具一起放入濃度0.8-2.4％的氯化鈣溶液中交聯固定5-10min；

（6）烘干成型：將經過交聯處理的坯膜進行烘干，并從成膜模具上揭下成品膜，獲得基于褐藻糖膠和多酚的抗菌活性的可食性膜成品。

進一步設置是所述的多酚為茶多酚或褐藻多酚。

進一步設置是所述的步驟（1）為將褐藻糖膠加入水中配成0.01g/mL的褐藻糖膠水溶液25mL，加0.02-0.16mL甘油，加0.04-0.20mL吐溫-80，加0.03-0.11g多酚，并在溫度30-60的攪拌20-40min溶解得到褐藻糖膠膜液，澄清。

進一步設置是所述的步驟（2）為將配置單膜液放入2-8℃冰箱30min去除膜液中的氣泡。

進一步設置是所述的步驟（3）為將25mL的褐藻糖膠膜液倒在水平放置的15cm×12cm的玻璃模具上，通過玻璃棒引流使膜液自然流平充滿整塊平板的玻璃模具，使形成的坯膜為15 cm×12 cm， 室溫下(25℃)凝固2h。

進一步設置是所述步驟（4）將凝固后的坯膜放入30-50℃烘箱中4-6h去除水分。

進一步設置是所述的步驟（6）中烘干為將膜連同成膜模具一起放入30-70℃烘箱中烘烤10-20 min。

本發明的創新機理是：

藻糖膠水溶液有一定的特性黏度和吸濕保濕性，通常水溶性多糖類物質通過與多價金屬離子（如鈣離子）能產生強凝膠透明度高的不溶性物質，從而提高水和氣體阻隔性成聚合膜，在膜液中添加甘油和乙二醇等增塑劑通過與基質形成分子間氫鍵能吸收水分進入膜網絡中，增加膜的柔韌性和彈性，提高兼容性、力學性能和阻隔性，而褐藻糖膠作為可食性膜的基質是可行的。

本發明的用褐藻糖膠和多酚制備具有抗菌活性的可食性膜具有抗細菌活性又具有能適合包裝食品的柔軟性、彈性和韌性，在包裝食品時對包裝袋內的環境起到抗氧化作用，具有優秀的應用價值。

本發明的方法不但可以克服傳統食品包裝的不可降解性及容易腐敗變質的弊端，而且還具有反應條件溫和、原料易得和綠色環保等優點，不僅具有重要的理論價值同時也具有潛在的應用前景。

下面結合說明書附圖和具體實施方式對本發明做進一步介紹。

附圖說明

圖1為本發明多酚含量對膜拉伸強度和斷裂伸長率影響圖；

圖2為本發明多酚含量對膜水蒸氣滲透系數的影響圖；

圖3為本發明甘油含量對膜拉伸強度和斷裂伸長率的影響圖；

圖4為本發明甘油含量對膜水蒸氣滲透系數的影響圖；

圖5為本發明吐溫-80含量對膜拉伸強度和斷裂伸長率的影響圖；

圖6為本發明吐溫-80含量對膜水蒸氣滲透系數的影響圖；

圖7為本發明CaCl₂對膜拉伸強度和斷裂伸長率的影響圖；

圖8為本發明CaCl₂對膜水蒸氣滲透系數的影響圖；

圖9為本發明溫度對膜拉伸強度和斷裂伸長率的影響圖；

圖10為本發明溫度對膜水蒸氣滲透系數的影響圖；

圖11為本發明多酚粉末、褐藻糖膠膜和褐藻糖膠/多酚（比例）膜的XRD圖；

圖12為本發明多酚粉末、褐藻糖膠膜和褐藻糖膠/多酚（比例）膜的FTIR圖；

圖13為本發明褐藻糖膠/多酚膜1000倍表面和斷面SEM圖；

圖14為本發明褐藻糖膠/多酚膜3000倍表面和斷面SEM圖；

圖15為本發明褐藻糖膠/多酚膜的抗菌性能圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發明進行具體的描述，只用于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限定，該領域的技術工程師可根據上述發明的內容對本發明作出一些非本質的改進和調整。

如圖1—圖15所示，一種褐藻糖膠和多酚制備具有抗菌活性的可食性包裝膜的方法，包括有以下步驟：

一、褐藻糖膠/多酚膜液的制備；通過平板膜液量試做得知，稱取褐藻糖膠0.25g加入蒸餾水中配成0.01g/mL濃度的液體25mL（即1%），加0.02-0.16mL（即0.08-0.64%）甘油，加0.04-0.20mL（即0.16-0.80%）吐溫-80，0.03-0.11g（0.12-0.44%）多酚（茶多酚）在溫度30-60℃的磁力控溫攪拌器上攪拌溶解20-40分鐘到膜液澄清；

二、褐藻糖膠/多酚膜液氣泡去除；取澄清膜液放入2-8℃冰箱30min去除膜液中的氣泡；

三、褐藻糖膠/多酚膜平鋪成型；然后將25mL的膜液倒在水平放置的的15cm×12cm的玻璃模具上，通過玻璃棒引流使膜液自然流平充滿整塊平板，使形成的膜為15 cm×12 cm，室溫下（25℃）凝固2h；

四、褐藻糖膠/多酚膜烘烤；凝固后的膜放入30-50℃烘箱中4-6去除水分；

五、褐藻糖膠/多酚膜交聯固定；膜連同玻璃板一起放入濃度0.8-2.4％的氯化鈣溶液中交聯固定5-10min；

六、褐藻糖膠/多酚膜烘干成型；膜連同玻璃板再放入30-70℃烘箱中10-20 min后取出揭膜。

分析測定

一、厚度；在膜上隨機取10個點用千分尺測量，求得平均值作為膜的厚度用于計算膜機械性質和水蒸氣透過系數；

二、膜拉伸強度和膜斷裂伸長率；膜的機械性能按照《塑料拉伸性能的測定》GB／T 1040.3-2006所列方法, 將膜裁成100 mm×l5 mm長條，用電子萬能試驗機測量。拉伸速率設定為10 mrn／min(恒速拉伸法)，夾持有效距離為80mm．重復測量3次，最后求出其求平均值；

拉伸強度以(MPa)表示，公式如下：

σt=p/bd （1）

式中P為斷裂負荷(N)；b為試樣寬度(mm)；d為試樣厚度(mm)。

斷裂伸長率以εt (％)表示，公式如下：

εt =(L-L_o)/L_o （2）

式中L_o為試樣原始標線距離(mm)；L斷裂時標線距離(mm)；

三、水蒸汽透過系數(WVP)；水蒸氣滲透系數,參考《塑料薄膜和片材透水蒸汽性試驗方法》GB/T1037-1988，測定膜透水蒸氣性用杯式法再適當簡化。首先在25℃左右的溫度下，把干燥過的CaCl₂，放人洗凈烘干的稱量瓶里，然后從膜中選擇均勻、完整的，均衡選取10個點用千分尺測出其厚度，最后用白膠帶將膜封口稱重。將稱重后的稱量瓶放入溫度為25℃、濕度為58%的恒溫恒濕箱中，24h后取出測定稱量瓶的增加的重量，由此算出水蒸氣滲透系數(Water Vapor Permeability，WVP)值[g·m／(m²·s·Pa)]，公式如下：

WVP=△m.d/(AtΔP) （3）

式中△m為杯增重量（g）；d為膜厚度（m）；A為透過面積（m²）；t為時間變化（s）；ΔP為膜兩側水分蒸汽壓差(1837.25Pa)；

四、膜衍射(XDR)；XRD采用德國布魯克公司的AXSX射線衍射計(D８Advance)進行測試,2θ角度范圍為10-90°；

五、膜紅外（FTIR）；傅里葉變換紅外光譜采用Thermo Fisher公司的NICOLET is10測試,采用ATR 模式，掃描范圍為,4000-500cm^-1,分辨率為4cm^-1；

六、膜電鏡(SEM)；復合膜的表面形貌采用日本日立公司的SU1510型掃描電鏡進行分析。加速電壓為10kV,放大倍數為1000和3000倍，測試前對樣品進行噴金處理；

七、膜抗菌性能測定；選擇無多酚褐藻糖膠膜和有多酚褐藻糖膠膜樣品進行抗菌性能測試，選用標準為修正的AATCC檢測方法100-1999，測試使用大腸桿菌O157：H7 (ATCC43895)和金黃葡萄球菌(ATCC6538)。在一片復合膜中央加入細菌懸浮液，然后將另一片復合膜蓋上，接觸1,5,10,30和60min后。再將試樣用pH值=7的緩沖液稀釋后將其放置在培養基中，在37℃下恒溫培養24h,測定細菌數量,計算細菌的減少量。

結果與分析

一、多酚含量對膜性能的影響

由圖1、2可知，25mL膜液中多酚含量在0.03-0.09g之間時，拉伸強度隨著含量的增加而上升，0.09g時最大；斷裂伸長率也隨著多酚含量的增加先增大后減小，0.07g時最大；而膜的水蒸氣滲透率也呈現先下降再上升后下降的趨勢。由于本實驗機械性能主要以拉伸強度為主，且水蒸氣滲透系數越低，具有性的多酚含量越高，膜的保鮮性能就相對越好，所以25mL膜液中多酚的最佳含量選取0.09g（即0.36wt%）；

二、甘油含量對膜性能的影響

由圖3、4可知，25mL膜液中甘油量在0.02-0.04mL時，膜的拉伸強度逐漸增大；0.04-0.16mL時，隨著含量的增大，拉伸強度減小；在0.02-0.08mL之間，膜的斷裂伸長率隨著甘油的含量的增加而增大，在0.08-0.12mL之間，膜的斷裂伸長率隨著甘油的含量的增加而下降，在0.12-0.16mL之間，膜的斷裂伸長率隨著甘油的含量的增加而增大，膜的水蒸氣滲透系數都隨著甘油的含量的增加而下降。這是由于甘油的相對分子質量較小且具有親水性，因而它能輕易插入到多糖分子鏈之間，然后與其中大部分的親水基團形成氫鍵，氫鍵的成功形成大大減弱多糖分子間或分子內本身的相互作，增加了膜的柔軟度，使膜得以有效地延展，柔韌性提高。但由于甘油含量的增加同時增大了滲透系數，不利于食品的保鮮，所以甘油的含量并不是越多越好，綜合抗拉強度，25mL膜液中添加0.04mL甘油（即0.16wt%）為較優值；

三、吐溫-80含量對膜性能的影響

由圖5、6可知，25mL膜液中吐溫-80含量在0.04-0.08mL：隨著吐溫-80含量增加，膜的拉伸強度緩慢下降，斷裂伸長率隨含量增加而上升，含量在0.08-0.16mL之間，膜的拉伸強度緩慢上升，在0.16mL時最高，斷裂伸長率隨含量增加而下降，含量0.16-0.2mL時，膜的拉伸強度緩慢下降，斷裂伸長率上升，吐溫-80含量0.04-0.08mL時，膜的水蒸氣滲透系數上升，吐溫-80含量0.08-0.20mL時膜的水蒸氣滲透系數緩慢下降；雖然從原理上看，吐溫-80-80會進入到褐藻糖膠分子鏈的間隙，使鏈間的空隙增大，減小鏈間的作用力，從而使鏈的流動性增加，以膜的拉伸強度為主，綜合考慮，25mL膜液中添加0.16mL的吐溫-80（即0.64wt%）最佳；

四、CaCl₂濃度對膜性能的影響

由圖7、圖8可知，在CaCl₂濃度0.8%-2.0%的范圍內，濃度的越高，抗拉強度慢慢增加，在CaCl₂濃度2.0%時最高，在氯化鈣濃度2.0%-2.4%時，抗拉強度慢慢下降，在CaCl₂濃度0.8%-1.2%時斷裂伸長率和水蒸氣滲透系數逐漸增大，隨著濃度的上升斷裂伸長率和水蒸氣滲透系數再下降又上升再下降；以膜的拉伸強度為主，綜合考慮，25mL膜的交聯CaCl₂濃度2.0%最佳；分析原因可能是一開始隨著交聯濃度的增加，鈣離子濃度增加，褐藻糖膠膜中鈣離子成分增多，膜性能增強，當濃度超過2.0wt%后，可能是膜表面形成了一種阻礙鈣離子進入的物質，導致膜的鈣含量減少，抗拉強度減少，膜性能降低；

五、溫度對膜性能的影響

由圖9、10可知，在烘干溫度30-50℃，膜的拉伸強度、斷裂伸長率和水蒸氣滲透系數隨溫度升高而增大；在50-70℃隨溫度的升高都呈現下降趨勢，50℃時膜的拉伸強度、斷裂伸長率最好，水蒸氣滲透系數相對較差，分析原因為：在膜液干燥時，受干燥溫度影響，膜液變化除了溶劑蒸發，成膜物質之間的相互作用也會隨溫度改變而改變。當溫度過低時，分子運動速度相對緩慢，溶劑蒸發速度過慢，使成膜時間變長，膜液分子間氫鍵也不利于形成，分子間無法有序交聯而形成有規則的聚集態結構，同時成膜大分子的展開也會不充分，從而影響成膜表面局部干燥不完全、膜會出現薄厚不均等缺陷，從而使膜性能低。溫度過高時，又因溶劑蒸發速度過快，從而使得成膜大分子被過早地固定下來，成膜分子間結構絮亂，易導致膜表面出現厚薄不均、裂縫、孔洞或褶皺等問題，從而降低膜的性能。溫度為50℃時膜液中水分蒸發速度在一個相對穩定適宜的水平，褐藻糖膠分子可以充分伸展，互相纏繞、穿插，形成定向有序排列，提高了膜結構致密程度和結晶程度，綜合考慮，膜的最佳烘干溫度為50℃；

六、X射線（XRD）分析

XRD可以用于研究混合物之間的相互作用，在混合體系中,如果兩種物質彼此之間沒有相互作用，混合體系將會呈現出單一物質各自的晶型，因此X射線衍射還可用來研究混合物的混合程度。圖11可知，多酚在２θ=13.88°、14.27°、16.05°處有幾個明顯的衍射峰，這是由于PVA 結晶區的形成，純褐藻糖膠在２θ=16.07°處有個明顯的衍射峰，而褐藻糖膠/多酚（多）復合膜在２θ=18.79°，褐藻糖膠/多酚（少）復合膜在２θ=18.13°處出現了一個新的衍射峰，而且復合膜衍射峰的形狀也與純褐藻糖膠和純多酚不同。這說明褐藻糖膠與多酚有較強的相互作用，即較高的混合程度。

七、紅外（FTIR）分析

圖12是多酚、褐藻糖膠膜、褐藻糖膠/多酚膜（多）和褐藻糖膠/多酚（少）的紅外譜圖，褐藻糖膠膜、褐藻糖膠/多酚膜（多）和褐藻糖膠/多酚（少）的紅外吸收光譜大體相似，褐藻糖膠和多酚共混后，褐藻糖膠分子中1730cm^-1 處峰明顯變弱，羥基伸縮振動峰增強并向低波數方向位移，說明分子間作用增強，分子內和分子間容易形成氫鍵，使分子鏈相互纏繞，形成更加穩定的網絡結構，同時兩種天然高分子間協同作用增強，表明多酚與褐藻糖膠參與了交聯反應，產生良好的相容性；

八、電鏡掃描(SEM)分析

復合膜的表面和斷面形貌采用SEM 表征，如圖13（放大倍數為1000倍）、圖14（放大倍數為3000倍）所示，膜的表面比較光滑，沒有出現突起物，說明沒有發生明顯相分離，也表明褐藻糖膠/多酚膜具有很好的相容性；

九、膜抗菌性能分析

褐藻糖膠/多酚膜與褐藻糖膠膜的對照抗菌性能如圖15所示，金黃色葡萄球菌的初始濃度為1.00×10⁶cfu/sample,大腸桿菌的初始濃度為1.23×10⁶cfu/sample。從圖15可以看出，無多酚的褐藻糖膠膜在30min內殺死61.14％金黃色葡萄球菌和24.83％大腸桿菌。這主要是因為復合膜中褐藻糖膠對細菌有一定的殺菌作用。加了多酚的褐藻糖膠/多酚膜，在接觸5min 后殺死98.92％金黃色葡萄球菌和100％大腸桿菌。從表中還可以看出,褐藻糖膠/多酚膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都具有更好的殺滅作用。

十、結論

為了研發新型可降解抗菌包裝材料，以褐藻糖膠為成膜基料，多酚為抗菌劑，添加了增塑劑甘油和吐溫-80通過測定膜的厚度、抗拉強度、斷裂伸長率和水蒸氣滲透系數等力學性質指標，確定復合抗菌膜成膜液的最佳組成（質量比）為：1％ 褐藻糖膠，0.36%多酚，0.16%甘油，0.64%吐溫-80，在CaCl₂濃度2.0%溶液中交聯交聯固定5min為最佳，烘烤溫度為50℃烘箱中10 min后取出揭膜，,得到的褐藻糖膠/多酚膜的力學性能較好，通過X射線、紅外光譜、電鏡掃描等分析手段證明褐藻糖膠和多酚能很好地結合成膜，褐藻糖膠/多酚膜的抗菌效果也較理想，為綠色包裝提供了一種新的抗菌材料和工藝參數，該膜可以在生物醫藥、食品包裝、水污染處理等方面有良好的發展前景。