本發明屬于生物基因工程技術領域，涉及到黃野螟過氧化氫酶基因全序列及其克隆方法。該基因編碼過氧化氫酶，該酶(cat)是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內的抗氧化酶，是生物建立防御系統的關鍵酶之一，其生物學功能是催化細胞內過氧化氫的分解，具有重要的生物化學研究價值。
技術背景
過氧化氫酶(catalase，cat)與超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)和過氧化物酶(peroxidase，pod)共同組成生物體抗氧化酶體系，清除細胞內的自由基。其中過氧化氫酶，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結合酶。它可促使h2o2分解為分子氧和水，清除生物體內的過氧化氫，從而使細胞免于遭受h2o2的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一。cat作用于過氧化氫的機理實質上是h2o2的歧化，必須有兩個h2o2先后與cat相遇且碰撞在活性中心上，才能發生反應。h2o2濃度越高，分解速度越快。對該基因的研究為可以作為靶標設計新型氧化酶抑制劑提供了基礎。
黃野螟(heortiavitessoides)屬鱗翅目(lepidoptera)，螟蛾科(pyralidae)，在我國廣泛分布于廣東、廣西、海南和云南等南方各省以及香港特別行政區。黃野螟是典型的寡食性害蟲，僅取食沉香屬(aquilaria)和漆樹屬(rhus)等少數幾種植物近年來，隨著海南、廣東和云南等地人工大規模種植白木香面積的日益擴大，黃野螟的危害也越來越嚴重。據廣東化州地區統計，黃野螟發生嚴重時，白木香的被害株率可高達90％以上。有關黃野螟過氧化氫酶基因目前無人研究，本發明填補了這一空白，對深入研究黃野螟體內保護酶系活性與殺蟲劑、昆蟲病毒、微孢子蟲等外界刺激強度相互作用關系以及昆蟲耐藥性和抗逆性提供基礎。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供黃野螟過氧化氫酶基因全序列及其克隆方法。
為了實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案：
1、黃野螟總rna的提取
將外地采集的黃野螟活成蟲經清洗、消毒、麻醉、液氮冷凍后保存在無菌去酶的ep管中，并置于-70℃低溫冰箱內保存備用。采用e.z.n.a.tmtotalrnakitii總rna提取試劑盒(omega)來提取黃野螟的總rna。
2、引物設計和3′race擴增
在本實驗室構建的cdna文庫中，查找并獲得了黃野螟過氧化氫酶基因的5′端序列，本發明是在此基礎之上進行3′race擴增，目的在于獲得黃野螟過氧化氫酶基因全序列。
3′race擴增的特異性引物為：
hv-cat-3′-outer：aaaaacgggagcaccagt；
hv-cat-3′-inner：cgctgatgccaagaaacg。
3、目的基因克隆及測序
獲得的pcr產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收相應目的dna片段，同pmd20-t載體進行連接，將連接后的產物轉化到e.colidh5α感受態細胞之中，然后進行amp抗性藍白斑的篩選，挑取合適的陽性菌落進行質粒提取。最后經由菌落pcr鑒定后進行測序。
4、序列拼接
將測序正確的序列與實驗室已構建的黃野螟cdna文庫中的過氧化氫酶基因序列進行不重復拼接，從而獲得黃野螟過氧化氫酶基因全長序列。
黃野螟過氧化氫酶基因全長序列，此序列如下：
此序列中劃線處標示的atg為初始密碼子，劃線處標示的taa為終止密碼子。
根據黃野螟過氧化氫酶酶基因orf(openreadingframe)全序列，得到其氨基酸序列。該序列如下：
本發明獲得了黃野螟過氧化氫酶基因全序列，通過對黃野螟成蟲的預處理、總rna的提取、3′race擴增、目的基因片段的克隆及其序列的拼接，得到了黃野螟過氧化氫基因全長序列，該序列全長2039bp，orf序列全長1524bp，共編碼507個氨基酸。
具體實施方式
以下實施例將本發明進一步說明。
1、黃野螟總rna提取
黃野螟成蟲采自廣州市華南農業大學啟林區土沉香林。經清洗、消毒、麻醉、液氮冷凍后保存在無菌去酶的ep管中，并置于-80℃低溫冰箱內保存備用。
采用trizol試劑盒進行黃野螟總rna的提取，具體步驟如下：
1)將冷凍于-80℃的黃野螟幼蟲樣品取出，按uniq-10柱式trizol總rna抽提kit提供的方法提取樣品的總rna。
2)在液氮預冷的研缽中充分研磨樣品至粉末。在液氮揮發盡時迅速轉移樣品粉末置于液氮中冷卻好的1.5ml離心管中。
3)按照每15-25mg樣品加入0.5mltrizol的比例在上述離心管中加入相應體積的trizol溶液，用渦旋混合器振蕩處理，使樣品充分裂解在trizol溶液中。
4)將裂解后的樣品于室溫下放置10min，使得核蛋白與核酸完全分離。12000rpm離心10min，取上清液。
5)加入0.1ml氯仿，上下劇烈震蕩30sec，室溫放置3min。12000rpm，4℃離心10min。離心后樣品分三層：上層水相，中間層和下層有機相。小心吸取上層水相轉移至干凈的離心管中，加1/2倍體積的無水乙醇，混勻。切勿吸取任何中間層，否則會出現染色體dna污染。
6)將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加至吸附柱中，靜置2min，12000rpm離心3min，倒掉收集管中的廢液。
7)將吸附柱放回收集管中，加入500μlrpesolution，靜置2min，10000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。
8)再次將吸附柱放入收集管中，加入500μlrpesolution，靜置2min，10000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。
9)將吸附柱放入收集管中，10000rpm離心2min。
10)將吸附柱打開蓋子于室溫放置2min，以徹底晾干吸附材料中殘留的乙醇，因為乙醇的殘留會影響實驗結果。但不要讓rna過于干燥，否則會影響洗脫效率。
11)將吸附柱放入干凈的1.5ml離心管中，在吸附膜中央懸空滴加40μldepc-treatedddh2o，靜置5min，12000rpm離心2min，將所得到的rna溶液置于-80℃溫冰箱內保存。
注意事項：上述rna實驗所涉及的試劑，須進行干熱滅菌(180℃，60min)處理，涉及到的一次性塑料容器、無菌水須進行高溫高壓滅菌處理。有關rna實驗使用所涉及到的試劑盒及無菌水都應該專用，須避免混用之后所引起的交叉污染。
2、cdna3′末端擴增
參照3′fullracecoresetver.2.0kit試劑盒進行，具體操作步驟如下：
1)反轉錄反應
反應體系如下：
pcr反應程序條件：42℃下反應60min，70℃下反應15min。
2)巢式pcr擴增
a)outerpcr擴增
反應體系如下：
pcr反應程序條件：94℃下預變性4min，94℃下變性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min，設置20個循環，然后72℃下延伸10min。
b)innerpcr擴增
反應體系如下：
pcr反應程序條件：94℃下預變性4min，94℃下變性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min，設置30個循環，然后72℃延伸10min。獲得的pcr產物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測其擴增的效果。
3、目的基因克隆及測序
1)從瓊脂糖凝膠中回收dna片段，按通用型dna純化回收試劑盒的方法進行回收：
a)柱平衡步驟：先將吸附柱cb2輕輕放入收集管中，往吸附柱cb2上方中加入平衡液bl500μl，在室溫條件下，12000rpm(～13.400×g)離心1min，然后棄掉收集管里的廢液，將吸附柱重新放回到收集管中。
b)將瓊脂糖凝膠上的目的dna單一條帶切下(盡可能地切掉多余的部分)，放入到事先已稱好重量的干凈離心管中，并再次稱取其重量。
c)向上述放有膠塊的離心管中加入與膠塊等倍體積的溶液pc(如果膠塊重量為100mg，其等倍體積可看作是100μl，那么需要加入pc溶液的體積是100μl)，55℃金屬浴放置15min左右，在這期間須不間斷地上下緩慢翻轉離心管，直到離心管里的膠塊完全溶解。
d)將上述所得溶液緩慢加入到吸附柱cb2中(吸附柱預先放進收集管中)，在室溫條件下，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液，將吸附柱再次緩慢放回到收集管中。
e)往吸附柱cb2里加入漂洗液pw(已加無水乙醇)600μl，靜置5min后進行離心。在室溫條件下，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液，將吸附柱cb2再次緩慢放回到收集管中。
f)往吸附柱cb2里再次加入漂洗液pw(已加無水乙醇)600μl，在室溫條件下，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液。
g)將吸附柱cb2再次放回到收集管里，在室溫條件下，12000r/min離心2min，盡可能地去掉漂洗液。然后將吸附柱放置在室溫條件5分鐘左右，直至徹底晾干。
h)將吸附柱cb2再一次放回到收集管里，往其吸附膜的中間處懸空滴入適量的洗脫緩沖溶液eb，置于室溫3min，12000r/min離心2min，所得溶液即為dna溶液。
i)將上述dna產物放于-20℃冰箱保存備用。
2)t載體連接
往pcr管中依次加入：pmd20-t載體1.0μl，前述目標dna產物3.0μl，去離子水1.0μl，solutioni溶液5.0μl，整個反應體系體積為10.0μl。在4℃冰箱中放置過夜。
3)轉化感受態細胞
a)取感受態細胞于冰水浴中融化，并分管為每管50μl。
b)每管加入4.5μl的連接產物，輕彈混均。置于冰水30min。
c)離心管置于42℃水浴里，熱激90s。
d)快速將離心管轉移到冰水浴中，冷卻細胞5min(此過程不要搖動離心管)。
e)吸取900μl無菌lb培養基(不含抗生素)加入到離心管中，混勻。
f)在37℃條件下，150r/min搖床振蕩培養45min。
g)將離心管里的內容物充分混勻，吸取100μl已轉化感受態細胞加到已配制好的平板培養基上，用彎頭玻璃棒(無菌)緩慢地將細胞均勻涂抹開來，放于室溫直至培養基表面直至液體被完全吸收后，將培養基倒置，在37℃條件下，培養箱中培養12-15h。
4)陽性重組子的鑒定及測序
a)在每個1.5ml的離心管中分別加入含氨芐的培養液600μl，每個平板都挑選出7個白色菌落與一個藍色菌落分別放入培養液中，37℃下，250r/min振蕩培養4h。取其菌液作為進行菌落pcr鑒定的模板。
b)菌落pcr
反應體系如下：
反應程序條件為：94℃下3min；94℃下30s；55℃下30s，設置30個循環；72℃下1min；72℃下10min。反應結束后吸取5μl的反應產物，并經瓊脂糖凝膠電泳實驗進行檢測。
c)將可能含有正確陽性重組子的克隆菌液送到生工生物公司進行測序。
4、將測序正確的序列與實驗室已構建的黃野螟cdna文庫中的超氧化物歧化酶基因5′端序列進行不重復拼接，去掉相互重疊的部分，從而獲得了黃野螟超氧化物歧化酶基因全長序列。