專利名稱：過氧化氫的生物傳感酶檢測電極及其的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種傳感器技術領域的裝置和方法，具體是一種過氧化氫的生物 傳感酶檢測電極及其的檢測方法。
背景技術：
過氧化氫作為一種常見的抑菌保鮮劑在食品行業中應用廣泛，如在水發食品 牛百葉、海蜇、魚翅以及蝦仁、帶魚、魷魚、水果罐頭、和面制品等的生產過程 中添加雙氧水，以提高產品的外觀形象。隨著生活水平的提高，人們對健康環保 意識逐漸增強，對食品品質的要求日益提高，食品安全問題在我國得到了越來越 廣泛的重視，有關過氧化氫的殘留危害的問題也日漸引起人們的注意。國內外很 多研究表明，過氧化氫殘留對機體某些生物大分子有很強的損傷作用，有較強的 致癌性。因而建立一種快速有效的檢測過氧化氫的方法，對于加強食品安全，保 護人民群眾的健康有重要的意義。
目前，測定過氧化氫的主要方法有分光光度法、原子吸收法、光化學方法以 及電化學方法等。其中采用電化學方法檢測過氧化氫，具有樣品處理簡單，操 作方便，靈敏度高等優點，成為當前研究過氧化氫檢測的一個熱點。當前檢測食 品及保健品中過氧化氫的國家標準方法是化學滴定法(GB1616-88高錳酸鉀法或 碘量法)，該方法的樣品前處理過程復雜，檢測時間長，滴定終點難掌握，并且 常因食品中含有還原性物質(如維生素C等)的存在導致檢測結果偏高，并且 檢測限一般為100ppm左右，達不到許多微量或痕量檢測要求。目前尚未見到有 關采用絲網印刷技術產業化制作一次性用于殘留過氧化氫檢測酶電極的相關報 道。
經對現有技術文獻的檢索發現，中國專利申請號為03132054.6，名稱為"一 種制備二氧化鈦凝膠膜電化學生物傳感器的方法"，該專利中采用二氧化鈦凝膠 膜對傳統電極進行修飾，然后采用電化學的方法來檢測過氧化氫。該方法制備修 飾電極的過程相當復雜，電極的準備時間超過2小時，制備出的修飾電極穩定性
差，修飾電極不能長期保存，當保存時間超過一個月時，電極的響應靈敏度下降 超過25%，因而不能大范圍推廣使用。
發明內容
本發明的目的在于針對上述現有技術的不足，提供了一種過氧化氫的生物傳 感酶檢測電極及其的檢測方法，使其易于產業化制作和一次性使用，并且大大縮 短了樣品處理和檢測時間，從而實現樣品的現場快速檢測。
本發明是通過以下技術方案實現的。
本發明涉及一種過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，包括電極基片、接線端
子、電極連線、工作電極、對電極、隔離片和蓋片，其中
接線端子、電極連線與工作電極連成一體組成一條電極基體，接線端子、電
極連線與對電極連成一體組成另一條電極基體，兩條電極基體相互平行，電極連
線表面上涂覆一層聚碳酸酯絕緣體，兩條電極基體設置在電極基片上，接線端子
和對電極均為裸露的導電材料薄膜，在相互平行的對電極和工作電極兩端覆蓋有
隔離片，隔離片與對電極、工作電極垂直放置，隔離片上部覆蓋蓋片，電極、隔
離片和蓋片之間的空隙形成加樣孔。
所述工作電極、對電極，其形狀均為正方形或長方形塊狀。
所述電極基片，是由聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚
乙烯、聚乙烯對苯二甲酸鹽中任選一種聚合物制成，該聚合物為片材或巻材。 所述隔離片，其雙面帶膠貼片，厚度均勻，是由聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、
聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚乙烯、聚乙烯對苯二甲酸鹽任選一種聚合物制成，該聚
合物為片材或巻材。
所述蓋片，選用透明聚氯乙烯片、聚酯片、聚碳酸酯片、聚苯乙烯片、聚酰
亞胺片、聚乙烯片、聚乙烯對苯二甲酸鹽片任選一種聚合物制成。 所述兩條平行電極連線之間的間距為2.5 mm 3mm。 所述工作電極，其與對電極之間的間距為0.8mm lmm。 本發明還涉及一種如應用上述過氧化氫的生物傳感酶檢測電極的檢測方法，
包括如下步驟
步驟一，在生物傳感酶檢測電極的工作電極上采用涂布法涂布一層殼聚糖 膜，晾干后，在電極的工作電極上滴加lnL-5pL2mg/mL的辣根過氧化物酶液， 低溫冷凍干燥，粘貼上隔離片，然后蓋上蓋片，在4'C環境下保存生物傳感酶檢
測電極；
步驟二，制備鹽酸鄰聯甲苯胺溶液取鹽酸鄰聯甲苯胺0.1g-0.3g，加入無 水乙醇1 mL -5mL，然后再加入二氧六環1 mL -5mL，最后用pH5.0的檸檬酸緩 沖液定容為100mL，避光保存；
步驟三，向待測的含有過氧化氫的樣品液中加入鹽酸溶液后，與鹽酸鄰聯甲 苯胺溶液等體積混合形成反應液，并將生成的反應液滴加到生物傳感酶檢測電極 中加樣孔；
步驟四，檢測工作電極與對電極之間的電流，若電流在電流檢測儀的檢測范 圍之內，則可通過電流檢測儀自動處理轉化，并與單片機中儲存的標準曲線進行 比對，轉化為過氧化氫的濃度，直接由顯示器顯示出檢測結果，若電流低于或高 于電流檢測儀的檢測范圍，則顯示器顯示過氧化氫濃度低于檢測范圍的最小值或 高于檢測范圍的最大值。
所述電流檢測儀的檢測范圍為5mg/L-200 mg/L。
本發明利用殼聚糖良好的成膜性和較好的粘結能力以及其內部的極性化學 基團，將辣根過氧化物酶(HRP)固定在生物傳感酶檢測電極中工作電極的表面， 制成能夠對過氧化氫進行快速檢測的電流型生物傳感器，過氧化氫與鹽酸鄰聯甲 苯胺在HRP的催化作用下發生氧化還原反應，產生電子遷移，形成電流，電流 強度與過氧化氫濃度成正比，檢測范圍為5mg/L-200mg/L。
與現有技術相比，具有如下有益效果
本發明具有絲網印刷電極結構簡單，加工方法簡便、成本低，用該絲網印刷 電極制成的傳感器檢測過氧化氫操作方便，樣品前處理簡單，檢測時間短，只需 6秒，而且抗干擾能力較強，檢測靈敏度高。
本發明能夠進行產業化生產，在食品中過氧化氫的現場快速檢測領域將有很 好的應用前景。
圖1為本發明中生物傳感酶檢測電極的平面結構示意圖； 圖2為本發明中生物傳感酶檢測電極的空間結構示意圖； 圖3為本發明中生物傳感酶檢測電極的橫向剖面示意圖； 圖4為本發明的實施例中標定的檢測結果曲線圖，
圖中，圖(a)為生物傳感酶檢測電極檢測過氧化氫時間與電流曲線圖，圖
(b)為過氧化氫濃度與電流的標準曲線圖5為本發明進行快速檢測殘留過氧化氫的工作原理圖。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案 為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護 范圍不限于下述的實施例。
如圖l、 2、 3所示，本實施例涉及一種過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，包 括電極基片l、接線端子2、電極連線3、工作電極4、對電極5、隔離片6和
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接線端子2、電極連線3與工作電極4連成一體組成一條電極基體，接線端 子2、電極連線3與對電極5連成一體組成另一條電極基體，兩條電極基體相互 平行，電極連線3表面上涂覆一層聚碳酸酯絕緣體8，兩條電極基體設置在電極 基片1上，接線端子2和對電極5均為裸露的導電材料薄膜，在相互平行的對電 極5和工作電極4兩端覆蓋有隔離片6，隔離片6與對電極5、工作電極4垂直 放置，隔離片6上部覆蓋蓋片7，對電極5、工作電極4、隔離片6和蓋片7之 間的空隙形成加樣孔9。
所述電極基片1，其長度為32mm 36mm、寬度為7mm 8mm、厚度為0.3 mm ~0.5mm;
所述接線端子2，其長度為4 mm 6mrn、寬度為1.5 mm 2mrn; 所述電極連線3，其長度為20 mm 25mrn、寬度為0.8 mm-lmm; 所述工作電極4，其形狀為實心方片狀，長度為2mm 3mm、寬度為2mm ~3mm;
所述對電極5，其形狀為實心方片狀，長度為2 mm 3mrn、寬度為2 mm ~3mm;
所述隔離片6，其長度為7~8mm、寬度為3 mm ~4mm、厚度為0.3 mm ~0.4mm;
所述蓋片7，其長度為10~14mm、寬度為7 mm ~8mm、厚度為0.2 mm 0.3mm;
所述兩條平行電極連線3，其之間的間距為2.5 mm ~3mm; 所述工作電極4，其與對電極5之間間距0.8 mm lmm。所述電極基片l，其材料為聚乙烯對苯二甲酸鹽，該聚合物為片材或巻材。 所述隔離片6，其材料為聚氯乙烯，該聚合物為片材或巻材。 所述蓋片7，其材料為聚氯乙烯片。
本實施例還涉及一種如應用上述過氧化氫的生物傳感酶檢測電極進行檢測
的方法，包括如下步驟
步驟一，在生物傳感酶檢測電極的工作電極上采用涂布法涂布一層殼聚糖
膜，晾干后，在電極的工作電極上滴加lpL-5nL2mg/mL的辣根過氧化物酶液， 低溫冷凍干燥，粘貼上隔離片，然后蓋上蓋片，在4t:環境下保存生物傳感酶檢 測電極；
步驟二，制備鹽酸鄰聯甲苯胺溶液取鹽酸鄰聯甲苯胺0.1g-0.3g，加入無 水乙醇1 mL -5mL，然后再加入二氧六環1 mL -5mL，最后用pH5.0的檸檬酸緩 沖液定容為100mL，避光保存；
步驟三，向待測的含有過氧化氫的樣品液中加入鹽酸溶液后，與鹽酸鄰聯甲 苯胺溶液等體積混合形成反應液，并將生成的反應液滴加到生物傳感酶檢測電極 中加樣孔；
步驟四，檢測工作電極與對電極之間的電流，若電流在電流檢測儀的檢測范 圍之內，則可通過電流檢測儀自動處理轉化，并與單片機中儲存的標準曲線進行 比對，轉化為過氧化氫的濃度，直接由顯示器顯示出檢測結果，若電流低于或高 于電流檢測儀的檢測范圍，則顯示器顯示過氧化氫濃度低于檢測范圍的最小值或 高于檢測范圍的最大值。
所述電流檢測儀的檢測范圍為5mg/L-200 mg/L。
本實施例中，采用絲網印刷技術將導電銀漿在電極基片上印刷兩條電極的基 體，它們上端為裸露的接線端子，它們的中間部分的電極連線表面上涂覆一層聚 碳酸酯絕緣體，下端為相互平行的工作電極和對電極(工作電極和對電極也可單 獨用碳漿印制)。
隔離片與工作電極和對電極的兩端對齊，形成的加樣孔的孔隙不能太大，加 樣孔主要是采用毛細現象讓反應液滴自動進入空隙，并與工作電極上的反應層相 接觸發生反應。
用300nm的二氧化鈦納米粉將工作電極拋光，再用質量百分比為50%的硝 酸浸泡處理，最后用蒸餾水沖洗3次，用涂布法在工作電極上涂布一層質量百分
比為3%水溶性殼聚糖溶液，晾干，然后滴加2微升3mg/mL的辣根過氧化物酶 液，4'C晾干，粘貼上隔離片，然后蓋上蓋片。
如圖4所示，標定過氧化氫溶液濃度與時間、電流的曲線圖
將質量分數30%的過氧化氫溶液采用高錳酸鉀滴定法滴定，然后分別稀釋成 以下濃度0.0mg/L、 5mg/L、 10mg/L、 20mg/L、 40mg/L、 80mg/L、 120mg/L、 160mg/L作為標準液。
將每種濃度的過氧化氫標準液與等體積的鹽酸鄰聯甲苯胺溶液混合均勻形 成反應液，取10微升滴在以上述方法制成的生物傳感酶檢測電極的加樣孔中，測 定并記錄電極的時間電流曲線，每一種過氧化氫濃度平行測定四次，過氧化氫濃 度與傳感器測定的電流在加樣后6秒時成良好正比例關系。
樣品處理
(1) 液體樣品用lmL移液器準確移取樣品0.9mL，加入0.1mol/L鹽酸100 微升，攪拌均勻，靜置5分鐘，然后離心，取上清液作為待測溶液。
(2) 固體樣品用電子天平稱取樣品1.00g，然后加入蒸餾水2mL攪拌l分 鐘，然后加入0.1mol/L鹽酸100微升，攪拌均勻，靜置5分鐘，然后離心，取上清 液作為待測溶液。
分別將上述液體樣品制成的待測溶液和固體樣品制成的待測溶液，與鹽酸鄰 聯甲苯胺溶液等體積混合滴加到已標定好的生物傳感酶檢測電極的加樣孔中，檢 測過氧化氫殘留，最低檢測限達到0.5mg/L。
如圖5所示，本實施例使用生物傳感酶檢測電極和電流檢測裝置進行快速檢 測殘留過氧化氫的工作原理圖，生物傳感酶檢測電極上HRP催化反應液中的過 氧化氫發生氧化還原反應，放出電子，電子再與反應液中的鹽酸鄰聯甲苯胺反應， 生成傳電子絡合物，電子在傳感器檢測儀的恒電位激勵下發生定向移動形成電 流，電流被轉換及放大后經過模數轉換器之后，由單片機將電信號轉換成過氧化 氫濃度直接從液晶顯示器上讀出，同時還將數據存儲到存儲器中。
本實施例重復性好，反應靈敏，檢測時間短，只需6秒，樣品處理方法簡單， 而且抗干擾能力較強，在食品中過氧化氫的現場快速檢測領域將有很好的應用前
學
權利要求
1. 一種過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，包括電極基片、接線端子、電極連線、工作電極、對電極，其特征在于，還包括隔離片和蓋片，其中接線端子、電極連線與工作電極連成一體組成一條電極基體，接線端子、電極連線與對電極連成一體組成另一條電極基體，兩條電極基體相互平行，電極連線表面上涂覆一層聚碳酸酯絕緣體，兩條電極基體設置在電極基片上，接線端子和對電極均為裸露的導電材料薄膜，在相互平行的對電極和工作電極兩端覆蓋有隔離片，隔離片與對電極、工作電極垂直放置，隔離片上部覆蓋蓋片，電極、隔離片和蓋片之間的空隙形成加樣孔。
2、 根據權利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所 述工作電極、對電極，其形狀均為正方形或長方形。
3、 根據權利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所 述電極基片，是由聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚乙烯、 聚乙烯對苯二甲酸鹽中任選一種聚合物制成，該聚合物為片材或巻材。
4、 根據權利要求l所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所述隔離片，其雙面帶膠貼片，厚度均勻，厚度為0.3mm 0.4mm。
5、 根據權利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所 述隔離片，是由聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酰亞胺、聚氯乙烯、聚乙烯、聚 乙烯對苯二甲酸鹽中任選一種聚合物制成，該聚合物為片材或巻材。
6、 根據權利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所 述蓋片，是由透明聚氯乙烯片、聚酯片、聚碳酸酯片、聚苯乙烯片、聚酰亞胺片、 聚乙烯片、聚乙烯對苯二甲酸鹽片中任選一種聚合物制成。
7、 根據權利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所 述兩條平行電極連線之間的間距為2.5 mm 3mm。
8、 根據權利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極，其特征是，所 述工作電極，其與對電極之間的間距為0.8 mm -lrnm。
9、 一種應用如權利要求1所述的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極的檢測方 法，其特征在于，包括如下步驟 步驟一，在生物傳感酶檢測電極的工作電極上采用涂布法涂布一層殼聚糖 膜，晾干后，在電極的工作電極上滴加lpL-5nL2mg/mL的辣根過氧化物酶液， 低溫冷凍干燥，粘貼上隔離片，然后蓋上蓋片，在4'C環境下保存生物傳感酶檢 測電極；步驟二，制備鹽酸鄰聯甲苯胺溶液取鹽酸鄰聯甲苯胺0.1g-0.3g，加入無 水乙醇1 mL -5mL，然后再加入二氧六環1 mL -5mL，最后用pH5.0的檸檬酸緩 沖液定容為100mL，避光保存；步驟三，向待測的含有過氧化氫的樣品液中加入鹽酸溶液后，與鹽酸鄰聯甲 苯胺溶液等體積混合形成反應液，并將生成的反應液滴加到生物傳感酶檢測電極 中加樣孔；步驟四，檢測工作電極與對電極之間的電流，若電流在電流檢測儀的檢測范 圍之內，則可通過電流檢測儀自動處理轉化，并與單片機中儲存的標準曲線進行 比對，轉化為過氧化氫的濃度，直接由顯示器顯示出檢測結果，若電流低于或高 于電流檢測儀的檢測范圍，則顯示器顯示過氧化氫濃度低于檢測范圍的最小值或 高于檢測范圍的最大值。
10、根據權利要求9所述的應用過氧化氫的生物傳感酶檢測電極進行檢測的 方法，其特征是，所述檢測范圍為5mg/L-200mg/L。
全文摘要
一種材料分析技術領域的過氧化氫的生物傳感酶檢測電極及其的檢測方法，生物傳感酶檢測電極包括電極基片、接線端子、電極連線、工作電極、對電極、隔離片和蓋片，在對電極和工作電極兩端覆蓋上隔離片，在隔離片上部覆蓋蓋片，電極、隔離片和蓋片之間的空隙形成加樣孔。本發明方法中，將辣根過氧化物酶固定在生物傳感酶檢測電極中工作電極的表面，制成能夠對過氧化氫進行快速檢測的電流型生物傳感器，過氧化氫與鹽酸鄰聯甲苯胺在HRP的催化作用下發生氧化還原反應，產生電子遷移，形成電流。本發明能大大縮短樣品處理和檢測時間，實現樣品中過氧化氫的快速檢測，且易于產業化制作和一次性使用。
文檔編號G01N27/327GK101393158SQ200810201618
公開日2009年3月25日 申請日期2008年10月23日 優先權日2008年10月23日
發明者劉國艷, 劉海峰, 柴春彥 申請人:上海交通大學