云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP?OA2及其制備方法與應用與流程

本發明屬于生物醫學領域，具體地說，涉及一種云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2及其制備方法與應用。

背景技術：

抗氧化劑是阻止氧氣不良影響的物質，它是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對人體損害的一類物質。目前已經發現了大量的抗氧化劑，這些抗氧化劑可以被分為以下兩大類：1)非基因編碼的小分子無助，如維生素E、維生素C、谷胱甘肽等；2)基因編碼的大分子物質，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、硫氧還蛋白等。這些抗氧化劑已經被廣泛應用于各種領域，包括健康、食品、化妝品及各種工業中，比如作為燃料和潤滑劑的穩定劑防止氧化，也可加在汽油中起到防止聚合從而避免引擎積垢形成的目的，單在2007年，工業用途的抗氧化劑的就創造了大約37億美元的收入。基于抗氧化劑的重要性，科學家們一直在孜孜不倦的尋找著新型抗氧化劑。

兩棲動物是水生動物過度到陸生動物之間的重要類群，其皮膚裸露，表面沒有毛發覆蓋，直接面對各種生存壓力，承當著諸多重要的生物學功能，比如抵御微生物入侵、體色調節、水鹽平衡調節等。已經有大量的研究證據表明，兩棲動物的皮膚能分泌大量的活性物質(主要是蛋白和多肽)使得其能完成這些重要的生物學功能。最近，在兩棲動物滇蛙的皮膚中發現了一類新型的抗氧化劑，其化學本質為多肽，和傳統的兩大類抗氧化劑不同，其由基因編碼，但分子量卻很小。此后，在一些兩棲動物皮膚中也發現了這一類物質，但和傳統的抗氧化劑相比，我們對這一類新型抗氧化劑的結構和功能了解還知之甚少。

云南臭蛙是中國特有的一種兩棲動物，廣泛分布于強紫外照射的云貴高原，根據其生境，我們推測其皮膚能分泌高效的新型抗氧化多肽使得其能抵御紫外照射所造成的傷害。對這些多肽的挖掘、結構和功能的研究一方面為我們理解兩棲動物適應高海拔強紫外照射生境提供新的分子線索，另外一方面能為我們提供新的、具有自主知識產權的抗氧化劑。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明針對上述的問題，提供了一種云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2及其制備方法與應用，通過云南臭蛙皮膚分泌分離純化得到的AOP-OA2具有結構新穎、簡單、活性強的特點。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2，抗氧化多肽AOP-OA1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發明還公開了一種云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2的制備方法，包括以下步驟：

1)原料預處理：取云南臭蛙皮膚分泌物，溶解于質量濃度為0.9％的生理鹽水，真空冷凍干燥，-80℃保存備用；

2)Sephadex G50分子篩：將步驟1)中制備得到的云南臭蛙皮膚分泌物凍干粉溶解于去離子水中，上Sephadex G50柱子，用Tris-HCl緩沖液進行洗脫，流速為2.0毫升/10分鐘，每10分鐘收集一管，測定其在280納米下的吸光度，收集合并具有抗氧化活性的洗脫峰；

3)高效液相色譜反相層析：將步驟2)中制備得到的洗脫液上樣于Hypersil ODS2柱子，實驗儀器為Waters 1525高壓液相系統，在流速為1毫升/分鐘的條件下，用乙腈在線性梯度條件下進行洗脫，監測波長為215納米，收集合并具有抗氧化活性的洗脫峰，濃縮干燥后得到目標物。

進一步地，步驟2)中的Sephadex G50柱子預先用20mM、pH6.8、含0.1M NaCl的Tris-HCl緩沖液平衡24h。

進一步地，步驟3)中的Hypersil ODS2色譜柱需預先用含體積濃度為0.1％三氟乙酸的超純水平衡。

進一步地，步驟3)中的乙腈為含0.1％三氟乙酸的乙腈。

進一步地，步驟3)中的線性梯度洗脫具體為：乙腈濃度從0％升至60％所消耗的時間為60分鐘。

本發明還公開了一種上述云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2在制備與抗氧化相關的藥物、保健品、化妝品中的應用。

與現有技術相比，本發明可以獲得包括以下技術效果：

1)本發明從中國產云南臭蛙的皮膚中得到了1個新的抗氧化多肽AOP-OA2，其抗氧化活性很強，約為維生素E的300倍。將本發明的云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2全序列結構經蛋白質數據庫進行搜尋比較，未發現有任何相同多肽。

2)純化得到的云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2在自由基ABTS+清除實驗中顯示了較強的抗氧化活性，揭示本發明云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2有潛在的應用前景。

3)云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2具有結構簡單、抗氧化活性強的特點。

當然，實施本發明的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本發明的一部分，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：

圖1為本發明云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2的G50分子篩層析圖；

圖2為本發明云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2的HPLC反相C₁₈柱層析圖，其中，1代表AOP-OA2峰；

圖3為本發明分離純化云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2的自由基ABTS⁺清除活性圖。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細說明本發明的實施方式，藉此對本發明如何應用技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據以實施。

實施例1：云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2分離純化和鑒定

1、分離純化

云南臭蛙活體采自云南保山，取其皮膚分泌物(溶解于質量濃度為0.9％的生理鹽水，這能最大化保持其生物學活性)，真空冷凍干燥濃縮至干粉，-80℃保存備用。

第一步：Sephadex G50分子篩：按照上述方法獲得皮膚分泌物凍干粉，溶解于去離子水中，取1毫升(蛋白與多肽總含量為100毫克)上預先用20mM Tris-HCl緩沖液(pH＝6.8，含0.1M NaCl)平衡24小時的Sephadex G50(GE Healthcare，超細)柱子(長度40厘米，內徑寬度1.5厘米)，用同樣的緩沖液進行洗脫，流速為2.0毫升/10分鐘，每10分鐘收集一管，測定其在280納米下的吸光度，所得的分離純化圖譜如圖1所示，其中AOP-OA2存在于圖所示峰。

第二步：高效液相色譜反相層析：

第一步所得樣品上樣于預先用超純水(含體積濃度為0.1％的三氟乙酸)平衡好的Hypersil ODS2柱子(伊利特，尺寸為4.6毫米×300毫米)，實驗儀器為Waters 1525高壓液相系統，在流速為1ml/min的條件下，用乙腈(含0.1％的三氟乙酸)在線性梯度(0-60％，60分鐘)條件下進行洗脫，監測波長為215毫米，所得的分離純化圖譜如圖2所示，圖中“2”所示為純化的天然云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2。

2、分子鑒定

氨基酸序列的測定：

純化得到的云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2在全自動蛋白質序列測定儀(島津PPSQ-31A)上經Edman降解法，測定了云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2氨基酸全序列，結果表明云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2具有本發明SEQ ID NO:1所示的結構。

實施例2：云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2的抗氧化活性

本發明利用自由基ABTS⁺清除活性實驗檢測拉云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2的抗氧化活性，結果表明云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2具有較強的抗氧化活性。

具體步驟與結果：7mM的ABTS在水中和2.8mM的過硫酸鉀混合，室溫黑暗環境中反應6個小時，使得ABTS被氧化成為ABTS⁺自由基，之后用去離子水稀釋50倍，取50uL稀釋液和50uL樣品混合，室溫黑暗環境下反應30分鐘，之后，在415nm波長下測其吸光度。自由基ABTS⁺的清除率(％)用下述公式進行計算：(A_blank-A_sample)×100/A_blank。不同濃度云南臭蛙抗氧化肽AOP-OA2的抗氧化活性如圖3所示。

上述說明示出并描述了發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解發明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環境，并能夠在本文所述發明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和范圍，則都應在發明所附權利要求的保護范圍內。