一株高效利用精氨酸且不積累瓜氨酸的嗜鹽四聯球菌的制作方法

本發明涉及一株高效利用精氨酸且不積累瓜氨酸的嗜鹽四聯球菌，屬于微生物領域。

背景技術：

醬油是我國的傳統發酵調味品，我國是醬油生產及出口大國。醬油是一種以大豆、小麥、麩皮等為原料，由多種微生物共同作用，經長期發酵而形成的具有獨特風味的調味品。醬油中含有多種可溶性蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、醇類、酯類、有機酸以及豐富的維生素、無機鹽等，營養價值十分豐富。

氨基甲酸乙酯(ethylcarbamate，簡稱ec)是發酵食品和酒精飲料生產過程中自然產生的副產物，具有致癌性和遺傳毒性，能夠導致肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等。2007年4月10日，世界衛生組織的國際癌癥研究機構(iarc)正式將氨基甲酸乙酯歸為2a類致癌物，與丙烯酰胺同等危險。氨基甲酸乙酯的存在，給醬油帶來了安全隱患，將使我國的醬油出口行業面臨新的考驗，影響我國的醬油出口經濟，從而降低我國傳統發酵文化的影響力。近年來，我國的重大食品安全問題屢有發生，食品安全關系到消費者的身體健康和生命安全，關系到社會穩定和國家信譽，從嚴控制及消除發酵制品中氨基甲酸乙酯含量是食品安全發展的必然趨勢。

在醬油生產前期，原料水解出大量精氨酸，這些精氨酸在一些乳酸菌和其他細菌的作用下，通過精氨酸脫亞氨基途徑(argininedeiminasepathway，簡稱adi途徑)被轉化為瓜氨酸。有研究表明在高鹽稀態醬油發酵過程中，氨基甲酸乙酯的前體物質是瓜氨酸和乙醇等。具體反應如下面的反應式所示：

醬油發酵是一個食品混菌發酵體系，生產上不允許使用基因工程菌或用基因工程手段改造生產菌株。因此尋找來源于醬醪微生物體系可降解精氨酸且不積累瓜氨酸的菌株，通過強化這一菌株來降低醬油中的ec和其前體瓜氨酸，可為建立消除食品混菌發酵體系中的有害微生物代謝物的方法提供研究基礎和理論支持。

嗜鹽四聯球菌(tetragenococcushalophilus)是一種革蘭氏陽性乳酸菌。主要存在于高鹽或高糖環境中，存在于醬醪發酵中后期，是產生風味物質的主要微生物之一，可以應用于醬油行業。在前期研究中，發明人篩選得到的嗜鹽四聯球菌r23cctccno:m2013480，擁有完整adi途徑，可以利用精氨酸且不積累瓜氨酸，是目前利用精氨酸與瓜氨酸能力最強的嗜鹽四聯球菌，但是其利用精氨酸和瓜氨酸的能力受精氨酸濃度、葡萄糖濃度及環境因素等影響較大。r23在3g/l以上精氨酸的環境中就表現為瓜氨酸積累，不能再消耗體系中的瓜氨酸，但在實際醬醪發酵環境中精氨酸濃度平均為5g/l，r23已不滿足工業應用要求。

表1嗜鹽四聯球菌r23及atcc保藏嗜鹽四聯球菌利用精氨酸能力

注：δarg為精氨酸消耗量；δcit為瓜氨酸積累量；δorn為鳥氨酸生成量

因此，篩選或者通過育種來獲得精氨酸和瓜氨酸利用能力增強的菌株，以有效減少醬醪中的瓜氨酸含量，從而減少醬油中ec含量，并且提高醬油的風味，對于提高嗜鹽四聯球菌的工業應用性能以及發展醬油產業，控制或減少發酵體系中的ec含量，提高發酵食品的安全性具有重要意義。

技術實現要素：

本發明目的在于提供一株在高鹽和高精氨酸濃度下仍能高效利用精氨酸且不積累瓜氨酸的嗜鹽四聯球菌，符合醬油生產環境要求，能有效降低醬油中氨基甲酸乙酯的含量。

本發明提供了一株在高鹽環境和高精氨酸環境下能夠高效利用精氨酸且不積累瓜氨酸的嗜鹽四聯球菌，本發明的嗜鹽四聯球菌l3h9，已于2017年5月9日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為cctccno:m2017250。

在本發明的一種實施方式中，誘變原始菌株為嗜鹽四聯球菌bber23。

本發明第二個目的是提供一種所述嗜鹽四聯球菌的培養方法，所述方法是將嗜鹽四聯球菌接種至含nacl的mrs培養基中，于30℃培養4-6天。

本發明第三個目的是提供一種所述嗜鹽四聯球菌的應用。

在本發明的一種實施方式中，所述應用是將所述嗜鹽四聯球菌應用于降低發酵食品中瓜氨酸的含量。

本發明第四個目的是提供所述嗜鹽四聯球菌在制備調味品中的應用。

在本發明的一種實施方式中，所述應用包括降低醬油中氨基甲酸乙酯含量。

本發明的第五個目的是提供一種含有所述嗜鹽四聯球菌的微生物菌劑。

在本發明的一種實施方式中，所述微生物菌劑能夠用于發酵食品中。

在本發明的一種實施方式中，所述微生物制劑為固態菌劑。

在本發明的一種實施方式中，所述微生物制劑為液體菌劑。

本發明的有益效果

本發明的一株能高效利用環境中精氨酸和瓜氨酸的嗜鹽四聯球菌，耐鹽，能在較高精氨酸濃度下消耗氨基甲酸乙酯的前體物瓜氨酸，從而降低環境中的氨基甲酸乙酯含量，在提高嗜鹽四聯球菌的工業應用性能以及發展醬油產業，控制或減少發酵體系中的ec含量，提高發酵食品的安全性上有潛在應用價值。本發明的嗜鹽四聯球菌是通過誘變育種的方法獲得，不采用基因工程菌或用基因工程手段改造生產菌株，符合食品行業要求，同時也提高了菌株效能。

生物材料保藏

嗜鹽四聯球菌l3h9tetragenococcushalophilusl3h9，于2017年5月9日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為cctccno:m2017250。

附圖說明

圖1嗜鹽四聯球菌l3h9在不同溫度下利用精氨酸能力分析。

圖2不同鹽濃度下嗜鹽四聯球菌l3h9鹽度耐受情況。

具體實施方式

氨基酸檢測培養基：酵母膏5g/l，牛肉膏5g/l，胰蛋白胨5g/l，nacl180g/l，葡萄糖0.5g/l，tween-801g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，mnso4·h2o0.05g/l，feso40.4g/l，檸檬酸三胺2g/l，caco30.1g/l，吡哆醛-5-磷酸0.05g/l，k2hpo42g/l，ph5.5。根據檢測需要添加相應氨基酸。

實施例1嗜鹽四聯球菌的誘變育種

將嗜鹽四聯球菌r23接種至含100g/lnacl的mrs液體培養基，30℃靜置培養至對數生長期，離心后棄上清，用pbs緩沖液(ph7.0)清洗菌體2～3次后，向離心管中加入5mlpbs緩沖液懸浮菌體，然后分別進行紫外誘變和等離子誘變。

(1)嗜鹽四聯球菌r23紫外誘變

①取5ml的菌懸液滴加在滅菌冷卻后的培養皿上，在紫外光下進行紫外誘變，誘變時間分別為。置于15w紫外燈下30cm處，分別照射處理：60s、90s、120s，每個處理重復3次，每次紫外照射后在黑暗培養箱中靜置30min。

②將誘變后的菌懸液在黑暗中稀釋至10^-4、10^-5倍，分別取0.1ml涂于平板上，每級稀釋液涂抹3個平板，以不進行照射作對照，紫外線照射以后的操作都在黑暗中進行，防止光修復。將涂勻的平板，置于30℃恒溫培養箱中避光培養4d。

③計算存活率，得出誘變致死曲線。將培養好的平板取出進行菌落計數，計算致死率。致死率(％)＝100－(處理后每0.2ml菌落數/對照每0.2ml菌落數)×100。

④根據致死率，選擇誘變時間為120s的處理條件下所得的突變株，進行高通量篩選。

(2)嗜鹽四聯球菌r23等離子誘變

①取10μl的菌懸液滴加在滅菌冷卻后的載玻片上，用artp進行等離子誘變，在100w和10slm的條件下誘變，誘變時間分別為3s、4s、5s。

②將誘變后的菌懸液轉移至裝有1ml生理鹽水的無菌管中，然后將樣品稀釋至10^-1～10^-3三個濃度，取稀釋液涂布于篩選培養基中，置于30℃恒溫培養箱中培養，每個處理重復三次。

③挑取菌落進行初篩(高通量篩選)。

從生長良好的平板上挑取單菌落轉接入含100g/lnacl的mrs培養基中，在30℃靜置培養四天，取500μl至30％甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。

將保藏的所述嗜鹽四聯球菌在含100g/lnacl的mrs固體培養基上劃線培養，于30℃靜置培養4天，挑取單菌落接入含100g/lnacl的mrs液體培養基的深96孔板中，平行3組，30℃靜置培養4天，8000rpm離心10min后去上清獲得菌體，用鹽酸鹽緩沖液(pbs，ph7.0)懸浮菌體。分別向3組深96孔板中加入3ml含0.5g/l瓜氨酸的3g/l精氨酸、3.5g/l精氨酸、4g/l精氨酸的氨基酸利用培養基，30℃靜置培養5天后，利用二乙酰一肟—氨基硫脲比色法測定培養液中l-瓜氨酸含量，復篩獲得優勢突變株4株。

利用高效液相色譜的方法測定優勢突變株培養體系中精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸含量，與原始菌株比較，選擇利用效率最高的突變株l3h9為目的菌株，觀測到精氨酸瓜氨酸利用率大大增高，鳥氨酸大量積累，且精氨酸利用率大于瓜氨酸利用率，因此，在高鹽和高精氨酸條件下所述嗜鹽四聯球菌l3h9能高效利用精氨酸且不積累瓜氨酸。

嗜鹽四聯球菌l3h9，已于2017年5月9日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為cctccno:m2017250。

實施例2嗜鹽四聯球菌利用精氨酸、瓜氨酸能力分析

挑取平板上活化好的嗜鹽四聯球菌l3h9單菌落接種于含100g/lnacl的mrs液體培養基中，30℃靜置培養4天，8000rpm離心10min取菌體，加入1ml磷酸鹽緩沖液(pbs，ph7.0)懸浮菌體。

向5ml離心管中分別加入3ml含0.5g/l瓜氨酸和3g/l精氨酸、4g/l精氨酸、5g/l精氨酸的氨基酸利用培養基，接種300μl菌液，30℃靜置培養5天后用hplc的方法檢測培養基中精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量，觀測到精氨酸、瓜氨酸利用率大大增高，鳥氨酸大量積累，且精氨酸利用率大于瓜氨酸利用率，因此，在高鹽和高精氨酸條件下這所述嗜鹽四聯球菌高效利用精氨酸并不積累瓜氨酸。具體數值如下：

表2野生菌與突變株利用精氨酸、瓜氨酸能力比較

注：δarg為精氨酸消耗量；δcit為瓜氨酸消耗量；δorn為鳥氨酸生成量

由表2結果可知，突變株l3h9在3g/l、4g/l、5g/l精氨酸環境中較原始菌株r23精氨酸利用能力分別提高60％、154％、249％，且在5g/l精氨酸的環境中仍能表現為降解瓜氨酸，可以適用于醬醪發酵中，避免瓜氨酸積累，有效減少了ec前體物質的生成。

實施例3嗜鹽四聯球菌在不同溫度下利用精氨酸能力分析

在醬油發酵的實際過程中，會有許多溫度變化，因此考察了嗜鹽四聯球菌l3h9在不同溫度下利用精氨酸的能力。

挑取平板上活化好的嗜鹽四聯球菌l3h9單菌落接種于100g/lnacl的液體培養基中，30℃靜置培養4天，8000rpm離心10min取菌體，加入1ml磷酸鹽緩沖液(pbs，ph7.0)懸浮菌體。

向5ml離心管中加入3ml含5g/l精氨酸和0.5g/l瓜氨酸的氨基酸利用培養基，接種300μl菌液，分別放至20℃、25℃和30℃靜置培養5天后，用hplc的方法檢測培養基中精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量，具體結果如圖1。由圖1結果可知，在各低溫情況下，突變株l3h9利用精氨酸能力與原始菌株r23相比均有提高，在20℃、25℃、30℃條件下利用精氨酸能力分別提高57.7％、47.8％、2.3％，更加適應各個溫度條件，可以利用精氨酸且基本不積累瓜氨酸，更適合醬醪發酵體系。

實施例4葡萄糖濃度對于突變株利用精氨酸和瓜氨酸能力的影響

根據已有研究表明，adi途徑是細菌的一條輔助供能途徑，因此細菌的adi途徑會受葡萄糖濃度的影響，因此考察了不同葡萄糖濃度對于嗜鹽四聯球菌突變株利用精氨酸和瓜氨酸能力的影響。

挑取平板上活化好的嗜鹽四聯球菌l3h9單菌落接種于100g/lnacl的液體培養基中，30℃靜置培養4天，8000rpm離心10min取菌體，加入1ml磷酸鹽緩沖液(pbs，ph7.0)懸浮菌體。

在5ml離心管中分別加入含5g/l精氨酸和0.5g/l瓜氨酸，葡萄糖濃度分別為2g/l、3g/l、5g/l、7g/l的氨基酸利用培養基，接種300μl菌液，在30℃靜置培養5天后，用hplc的方法檢測培養基中精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量，具體數值如下：

表3葡萄糖濃度對野生菌與突變株利用精氨酸和瓜氨酸能力的影響

注：δarg、δcit、δorn為積累量

由表3結果可知，突變株l3h9在各葡萄糖濃度下利用精氨酸的能力相較于原菌株r23相比均有顯著提高，在2g/l、3g/l、5g/l和7g/l葡萄糖環境中利用精氨酸能力較r23相比分別提高5.05g/l、5.62g/l、3.41g/l和1.22g/l，受葡萄糖濃度抑制作用影響更小，且在高糖濃度下仍能利用精氨酸且不積累瓜氨酸，更適合醬醪發酵體系。

實施例5突變株l3h9耐鹽性考察

在醬醪發酵過程中，環境表現為高鹽脅迫，是否能耐高鹽也關系到嗜鹽四聯球菌在醬醪發酵中的應用能力，因此考察了突變株l3h9與原始菌株r23在不同鹽濃度下的生長情況，具體做法如下：

挑取平板上活化好的嗜鹽四聯球菌l3h9和r23單菌落分別接種于含100g/l、180g/l、220g/l、250g/lnacl的mrs液體培養基中，30℃靜置培養，在生長過程中記錄其在600nm下的吸光值(od600)，最終獲得突變株l3h9與原菌株r23在各鹽濃度下的最大od600值，具體數據如圖2。由圖2結果可知，突變株l3h9與原始菌株r23相比，在nacl濃度為180g/l和220g/l時，耐受能力基本相同；在最適生長條件nacl濃度100g/l和高鹽濃度250g/l時，突變株l3h9耐受能力較r23分別提高6.5％和20.9％，在高鹽條件下生長能力更強，更適宜于醬醪發酵體系。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動和修飾，因此本發明的保護范圍應該以權力要求書所界定的為準。