酵母菌DD12?7菌株及其應用的制作方法

本發明涉及酵母菌dd12-7菌株及其應用。
背景技術：
：1963年，bevan和makower首次在保存的釀酒酵母菌（saccharomycescerevisiae）中發現酵母菌株間存在著相互殺死的現象，進而發現一種具有嗜殺活性的酵母菌，它分泌的外毒素能抑制或殺死野生酵母菌。嗜殺酵母分泌的嗜殺毒素稱為嗜殺因子，能夠殺死敏感酵母菌株，但對嗜殺酵母本身卻沒有嗜殺作用，也就是說具有免疫性。從已純化和表征的嗜殺毒素來看，嗜殺酵母所產的嗜殺毒素多為蛋白質或糖蛋白，在生物學特性上不耐熱、對蛋白酶敏感。嗜殺酵母分泌的嗜殺因子可作為抑制某些病原酵母及類酵母的抗真菌藥制劑。白色假絲酵母又稱白色念珠菌（candidaalbicans），是一種真菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，腸道及陰道，一般在正常機體中數量少，不引起疾病，當機體免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制約作用失調，則本菌大量繁殖并改變生長形式（芽生菌絲相）侵入細胞引起疾病。技術實現要素：本發明的目的之一是提供酵母菌dd12-7菌株。本發明目的之二涉及上述酵母菌株的應用。具體地，涉及應用該酵母菌株生產抗白色假絲酵母（candidaalbicans）的嗜殺因子的方法。本發明提供酵母菌株，為擬威爾酵母(williopsissp.)dd12-7，其保藏號為cgmccno.9833，具有分泌抗白色假絲酵母的嗜殺因子能力。該酵母菌來源于海洋，分離純化自遼寧丹東鴨綠江入海口沉積物。應用上述酵母菌株生產抗白色假絲酵母（candidaalbicans）的嗜殺因子的方法，在培養基中培養williopsissp.dd12-7使細菌分泌抗白色假絲酵母嗜殺因子，以在細菌和培養基中聚集了抗白色假絲酵母嗜殺因子后，從培養基和細菌內回收并提純。所述培養基為ypd培養基，其中包含葡萄糖1.5~3%、蛋白胨1.5~3%和酵母粉0.5~2%。所述培養為振蕩培養，在20~30℃和ph4.5~5.0下進行，轉速100~150rpm，發酵時間60~80h。本發明的優點是：從海洋環境中分離出產嗜殺因子的williopsissp.dd12-7菌株，其所產嗜殺因子能夠殺滅致病菌白色假絲酵母。該菌株dd12-7具有營養要求簡單，發酵周期短的特點，因此用該菌株生產抗白色假絲酵母的嗜殺因子具有很高的成本優勢和良好的應用前景。本發明所述酵母菌在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為：cgmccno.9833，保藏日期為：2014年10月19日，分類命名為：擬威爾酵母williopsissp.。附圖說明圖1嗜殺酵母初篩結果。圖2嗜殺因子粗提液復篩結果。圖3純化嗜殺因子對敏感菌的作用。具體實施方式以下結合具體的實施例對本發明作進一步的說明，其中以下采用的原料或者試劑，如無特殊指明均為市售。實施例1ypd培養基：1l培養基中含有：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%，nacl2%和甘油15%，培養基用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液配制，調節ph值至4.5。檢測培養基：1.0%（w/v）酵母粉，2.0%（w/v）葡萄糖，2.0%（w/v）蛋白胨，2.5%-3.5%（w/v）瓊脂，1.5mg/100ml美藍，用0.05m的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液控制ph4.5，緩沖液用蒸餾水配制。1.采集樣品：采集遼寧丹東鴨綠江入海口處表層海水，加入液體ypd培養基中震蕩培養3天。將0.1ml該液體培養基涂布于固體ypd平板，培養3天后挑取單菌落進行初篩。2.初篩：以白色假絲酵母（candidaalbicans）作為敏感菌，將細胞含量為107~108cells/ml的敏感菌用滅菌的棉簽沾取涂布于平板中，將1中挑取的酵母菌單菌落點到檢測培養基的平板上，培養3天后挑選出周圍有透明圈的菌株。初篩結果見圖1。3.復篩：通過比較嗜殺活力進行復篩，得到具有高產嗜殺因子的一株酵母菌株。將初篩中具有抗白色假絲酵母的菌株進一步在ypd平板中純化，后挑取單菌落于裝有50ml產嗜殺因子培養基的250ml三角瓶，在28℃，140rpm培養3天，發酵液經5000×g離心5min得上清，在涂有敏感菌的檢測培養基上放上牛津杯，取250ul的發酵清夜加到牛津杯當中，28℃培養3天。篩出具有高嗜殺活性的酵母菌株，如圖2所示，牛津杯周圍有非常明顯的透明圈，表明發酵液中的嗜殺因子對檢測培養基平板上的白色假絲酵母具有很強的殺滅作用。4.菌株通過形態觀察和生理生化鑒定白色奶油樣菌落，細胞出芽生殖，有簡單的假菌絲。生理生化特性如下：發酵實驗：葡萄糖麥芽糖半乳糖蔗糖乳糖棉子糖蜜二糖+-++-++同化實驗：葡萄糖麥芽糖半乳糖蔗糖乳糖棉子糖蜜二糖可溶性淀粉++++++++海藻糖纖維二糖d-果膠糖木糖l-果膠糖-+--+通過比較嗜殺活力進行復篩，得到具有高產嗜殺因子的一株酵母菌株。該菌株通過形態觀察和生理生化鑒定為williopsissp.。菌株編號：dd12-7。生產嗜殺因子的液體培養基為ypd培養基，其組成為：1l培養基中含有：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%，nacl2%和甘油15%，培養基用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液配制，調節ph值至4.5。實施例2嗜殺因子的生產在培養基中培養williopsissp.dd12-7使細菌分泌抗白色假絲酵母嗜殺因子，以在細菌和培養基中聚集了抗白色假絲酵母嗜殺因子后，將培養基離心收集上清液，即為嗜殺因子粗提液。培養基為產嗜殺因子培養基，其中包含葡萄糖2%、蛋白胨2%，酵母粉1%，nacl2%和甘油15%，培養基用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液配制，ph調為4.5。培養為振蕩培養，在28℃和ph4.5下進行，轉速140rpm，發酵時間72h。提純工藝：取發酵液經10kda的超濾膜濃縮，然后過deaesepharosefastflow離子交換柱進行陰離子交換，所得收集液經sephadexg50tm凝膠過濾，純的嗜殺因子。采用實施例1中第3步驟的方法，即在涂有敏感菌的檢測培養基上放上牛津杯，取250ul的純化的嗜殺因子加到牛津杯當中，28℃培養3天，如圖3所示，純化的嗜殺因子對白色假絲酵母具有很強的殺滅作用，牛津杯周圍的透明圈非常明顯。以上實施實例對本發明不同的實施過程進行了詳細的闡述，但是本發明的實施方式并不僅限于此。所述
技術領域：
的普通技術人員依據本發明中公開的內容，均可實現本發明的目的。當前第1頁12