一種黑蒜多糖提取物的制備工藝及應用的制作方法

本發明涉及植物提取技術領域，特別涉及一種黑蒜多糖提取物的制備工藝及應用。

背景技術：

黑蒜(blackgarlic)，黑蒜又名黑大蒜、發酵黑蒜、黑蒜頭，是用新鮮的生蒜，帶皮放在高溫高濕的發酵箱里發酵60～90天，讓其自然發酵制成的食品。

目前，我國心血管病人群突破2.9億，冠心病的年發病人群突破64‰，腦中風年發病率165～245/10萬。最近5年來，腦中風病正以每年近13％速度上升，有的地區有40％是中年人。大量實驗和臨床資料表明，冠心病、心肌梗死、腦梗塞、彌漫性血管內凝血、深部靜脈血栓等心腦血管病的發生、發展與血脂、血粘、凝血及血小板聚集密切相關，特別是凝血及血小板聚集起到關鍵性作用。目前抗凝血及抗血小板聚集的藥物主要包括肝素、華法林、阿司匹林、水蛙素等，這些準字藥品都具有不同程度的毒副作用，口服常規劑量的抗凝藥物增加腦出血的危險性高達7-10倍。目前，盡管西醫學在心腦血管病的臨床治療上達到了很高水平，但也只能是治標，冠心病、腦中風都無法治愈。

血管生成又稱為血管新生，是指毛細血管從原血管以出芽方式形成新血管床的過程。通常存在于胚胎形成和產后組織正常生長的過程中，成年女性生殖系統子宮內膜血管的周期性反復重建和組織受損后正常的修復也有血管生成的參與。出生后的血管再生方式主要包括血管生成和動脈生成。血管生成與動脈生成過程中可以發現兩者在發生的部位、誘發和調節因素、結果方面有著一定的區別和聯系。大部分的缺血性血管疾病需要同時促進血管生成和動脈生成。

為此，尋找能有效抗血小板聚集和/或促進血管生成的有效組藥物或有效提取物是一件十分棘手的事情。目前，關于黑蒜的藥理研究主要集中在降血脂、降血糖、抗腫瘤、提高免疫力以及營養學功效等方面，主要由黑蒜中的大蒜素、含硫化合物等來發揮作用，但是對其有效成分的其他藥理作用研究較少，更沒有關于抗血小板聚集和/或促進血管生成方面的應用報道。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種黑蒜多糖提取物的制備工藝及應用，使得所提取的黑蒜多糖提取物能夠顯著抗血小板凝集和促進血管生成。

為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：

針對目前關于黑蒜藥理研究的空白，本發明提出了黑蒜在制備抗血小板聚集和/或促進血管生成的藥物和/或保健品中的應用。

同時，更為具體地，本發明還提出了黑蒜多糖提取物在制備抗血小板聚集和/或促進血管生成的藥物和/或保健品中的應用。

在本發明所進行的黑蒜多糖提取物藥理試驗中，所述黑蒜多糖提取物參照如下制備工藝獲得：

步驟1、將黑蒜用水或乙醇加熱提取，固液分離，取上清液，得黑蒜提取液；

步驟2、將黑蒜提取液回收溶劑，得黑蒜濃縮液；

步驟3、向黑蒜濃縮液中加入乙醇，靜置，所得沉淀物經過處理，獲得黑蒜多糖提取物。

其中，作為優選，步驟1為將黑蒜用2-50倍于黑蒜重量的水或乙醇溶液加熱提取，固液分離，沉淀物重復加熱提取1-2遍并固液分離，合并所有固液分離后的上清液，得黑蒜提取液。

作為優選，步驟1所述水或乙醇溶液的重量是黑蒜重量的6倍、8倍、10倍、15倍或50倍，所述乙醇溶液的質量百分數不大于15％，例如5％、10％或15％；而加熱提取為在80-100℃加熱提取15-60min，更具體地可以是在100℃加熱提取15min、在80℃加熱提取60min、在95℃加熱提取30min、在85℃加熱提取25min或在90℃加熱提取40min。

作為優選，步驟2為將黑蒜提取液在低于80℃條件下回收溶劑，得黑蒜濃縮液；在本發明具體實施過程中，回收溶劑時的溫度也可以在70℃以下、68℃以下、62℃以下、60℃以下或58℃以下，同時也可以包含這些端點值。

作為優選，步驟3為向黑蒜濃縮液中加入其體積2-5倍的質量百分數為90-100％的乙醇溶劑，攪拌均勻，放于0～25℃的條件下靜置3-12小時，所得沉淀物經過處理，獲得黑蒜多糖提取物；對于所加入的乙醇溶劑，可以是2倍于黑蒜濃縮液體積的質量分數為100％的乙醇溶劑、5倍于黑蒜濃縮液體積的質量分數為90％的乙醇溶劑、3倍于黑蒜濃縮液體積的質量分數為95％的乙醇溶劑、4倍質量分數為95％的乙醇溶劑或3.5倍于黑蒜濃縮液體積的質量分數為95％的乙醇溶劑；對于靜置環境，可以是在0℃的條件下靜置3小時、在25℃的條件下靜置12小時、在4℃的條件下靜置6小時、在10℃的條件下靜置8小時或在15℃的條件下靜置10小時。

作為優選，所述經過處理具體為：將沉淀物用質量百分數為75-85％的乙醇溶劑洗滌1-5次，接著取沉淀物用水溶解。在具體實施過程中，可以用質量百分數為85％的乙醇溶劑洗滌1次、用質量百分數為75％的乙醇溶劑洗滌2次、用質量百分數為80％的乙醇溶劑洗滌3次、用質量百分數為78％的乙醇溶劑洗滌4次或用質量百分數為83％的乙醇溶劑洗滌2次。

本發明所獲得的黑蒜多糖提取物藥理學試驗結果顯示，其具有很好的促進斑馬魚血管生成作用，且具有顯著性差異。同時在對轉基因斑馬魚胚胎的毒性試驗中，沒有毒性。同時，所述黑蒜多糖提取物具有很好的抗血小板聚集作用，與對照組相比，效果明顯。正是基于上述優異的技術效果，本發明提出了黑蒜及其提取物在上述兩個方面的藥物和/或保健品的制備中的應用。

對于藥物和保健品，可以采用醫學或食品可接受的載體、賦形劑、賦形劑和/或填充劑，制成任何一種臨床上或藥學上可接受的劑型的藥物，或者符合保健食品要求的保健品，如可將其制成口服制劑、注射劑等。口服制劑如常規的固體制劑如片劑、膠囊、軟膠囊等；液體制劑如口服液，合劑、糖漿劑等。

由以上技術方案可知，通過本發明工藝制備的黑蒜多糖提取物，在藥理學試驗中具有很好的抗血小板聚集以及促進血管生成的作用，且在基因斑馬魚胚胎的毒性試驗中無毒，可以通過制劑學知識，運用于抗血小板聚集和/或促進血管生成相關產品中。

附圖說明

圖1所示為各實施例樣品對斑馬魚胚胎毒性實驗結果；

圖2所示為斑馬魚完整與缺陷節間血管示意圖；其中，1為缺陷性血管(defective)；2為節間血管(isvs)；3為背部脊索血管(dlav)；4為主動脈(da)；5為完整血管(intact)；

圖3所示為各實施例樣品對促斑馬魚血管生成作用結果；

圖4所示為實施例2、3樣品對斑馬魚節間血管長度的實驗結果；

圖5所示為實施例2、3樣品對斑馬魚節間血管數量的實驗結果，defective表示缺陷型血管，intact表示完整血管，完整血管柱形均高于缺陷型血管柱形。

具體實施方式

本發明公開了一種黑蒜多糖提取物的制備工藝及應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明所述應用及制備工藝已經通過實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的工藝和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。

以下就本發明所提供的一種黑蒜多糖提取物的制備工藝及應用做進一步說明。

實施例1：黑蒜多糖提取物的制備

取黑蒜500g，按重量份比，加入黑蒜重量10倍份的水，加熱至100℃時，繼續加熱提取15min，直接過濾，固液分離，取上清液，得黑蒜提取液；將黑蒜提取液在溫度低于80℃下回收溶劑，得黑蒜濃縮液；按體積比，向黑蒜濃縮液中加入2倍其體積的質量分數為100％的乙醇溶劑，攪拌均勻，放于0℃的條件下靜置3小時，取沉淀物，用質量分數為85％的乙醇溶劑洗滌1次，接著取沉淀物用水溶解，即得黑蒜多糖提取物。

實施例2：黑蒜多糖提取物的制備

取黑蒜100g，按重量份比，加入黑蒜重量50倍份的質量分數為15％的乙醇溶劑，加熱至80℃，繼續加熱提取60min，固液分離，取上清液，得黑蒜提取液；將黑蒜提取液在溫度低于62℃下回收溶劑，得黑蒜濃縮液；按體積比，向黑蒜濃縮液中加入5倍其體積的質量分數為90％的乙醇溶劑，攪拌均勻，放于25℃的條件下靜置12小時，取沉淀物，用質量分數為75％的乙醇溶劑洗滌2次，接著取沉淀物用水溶解，即得黑蒜多糖提取物。

實施例3：黑蒜多糖提取物的制備

取黑蒜500g，加入黑蒜重量6倍份的水，加熱至95℃，繼續加熱提取30min，離心，固液分離，取上清液，再取沉淀物加入沉淀物重量8倍的水，依上法繼續提取2次，離心，固液分離，合并上清液，得黑蒜提取液；將黑蒜提取液在溫度為58℃下回收溶劑，得黑蒜濃縮液；按體積比，向黑蒜濃縮液中加入3倍其體積的質量分數為95％的乙醇溶劑，攪拌均勻，放于4℃的條件下靜置6小時，取沉淀物，用質量分數為80％的乙醇溶劑洗滌3次，接著取沉淀物用水溶解，即得黑蒜多糖提取物。

實施例4：黑蒜多糖提取物的制備

取黑蒜500g，按重量份比，加入黑蒜重量8倍份的質量分數為5％的乙醇溶劑加熱至85℃，繼續加熱提取25min，勻漿、離心，固液分離，取上清液，再取沉淀物加入沉淀物重量2倍的5％的乙醇溶劑，依上法繼續提取1次，勻漿、離心，合并上清液，得黑蒜提取液；將黑蒜提取液在溫度為60℃下回收溶劑，得黑蒜濃縮液；按體積比，向黑蒜濃縮液中加入4倍其體積的質量分數為95％的乙醇溶劑，攪拌均勻，放于10℃的條件下靜置8小時，取沉淀物，用質量分數為78％的乙醇溶劑洗滌4次，接著取沉淀物用水溶解，即得黑蒜多糖提取物。

實施例5：黑蒜多糖提取物的制備

取黑蒜500g，按重量份比，加入黑蒜重量15倍份的水，加熱至90℃，繼續加熱提取40min，過濾，固液分離，取上清液，再取沉淀物加入沉淀物重量10倍的水，依上法繼續提取1次，過濾，合并上清液，得黑蒜提取液；將黑蒜提取液在溫度為70℃下回收溶劑，得黑蒜濃縮液；按體積比，向黑蒜濃縮液中加入3.5倍其體積的質量分數為95％的乙醇溶劑，攪拌均勻，放于15℃的條件下靜置10小時，取沉淀物，用質量分數為83％的乙醇溶劑洗滌2次，接著取沉淀物用水溶解，即得黑蒜多糖提取物。

實施例6：黑蒜多糖提取物抗血小板聚集藥理試驗

1.實驗動物

雄性家兔7只，體重2.0～2.2kg，購自江寧縣青龍山動物養殖場。動物于25℃、相對濕度60～75％條件下飼養1周后用于實驗。

2.儀器和試劑

lg-paber-i血小板聚集凝血因子分析儀(北京世帝科學儀器公司)，80-2臺式低速離心機(上海醫療器械(集團)有限公司手術器械廠)，sartorius分析天平(北京多利斯天平有限公司)。

二磷酸腺苷鈉鹽(adp)，花生四烯酸(aa，sigma公司進口分裝)，枸櫞酸鈉(南京化學試劑有限公司)，鹽酸普魯卡因(上海旭東海普藥業有限公司)，0.9％氯化鈉注射液(安徽雙鶴藥業有限責任公司)。

3.實驗樣品制備

取實施例1-5所制備的黑蒜多糖提取物，用生理鹽水進行溶解，樣品濃度按提取物干燥品計，單位為mg/ml；分別編號為樣品1-5。

白蒜對照組：取白蒜1kg，按實施例3方法進行制備，得到白蒜多糖提取物，用生理鹽水進行溶解，樣品濃度按提取物干燥品計，單位為mg/ml；編號為白蒜對照組。

空白對照組：以等體積的生理鹽水替代作為空白對照組。

4.實驗方法和實驗結果

實驗方法：取實驗家兔用鹽酸普魯卡因局部麻醉后，手術分離頸總動脈取血，用3.8％枸櫞酸鈉1：9抗凝，以500r/min離心10min，制備富血小板血漿(prp)，剩余部分再以3000r/min離心10min，制備貧血小板血漿(ppp)，按born氏比濁法進行血小34板聚集實驗。測定管中加入prp260μl、各實驗樣品30μl，溫孵5min，分別以10μlaa(終濃度0.35mmol/l)和10μladp(終濃度10μmol/l)為誘導劑，觀察記錄5min內最大聚集率。計算各實驗樣品對aa和adp誘導的血小板聚集抑制率，結果分別見表1和表2。

表1各實驗樣品對aa誘導血小板聚集抑制結果

表2各實驗樣品對adp誘導血小板聚集抑制結果

由表1和表2的實驗結果可以看出，實施例1-5對aa、adp誘導血小板聚集均有抑制作用，而白蒜對照組和空白對照組樣品則沒有這個功效。

實施例7：黑蒜多糖提取物促血管生成作用藥理試驗

1.實驗動物

細胞轉基因斑馬魚魚系tg(fli-1:egfp)在標準條件下即14小時白天/10小時夜晚周期進行喂養和繁殖，斑馬魚(3－12月)胚胎在自然交配條件下獲得，并在28.5℃的胚胎培養液中孵育。

2.儀器和試劑

轉盤式共聚焦顯微鏡系統(olympus)；vegfrtyrosinekinaseinhibitorii(vri)購自calbiochem公司。

3.實驗樣品制備

取實施例1-5所制備的黑蒜多糖提取物，用斑馬魚培養液溶解樣品，樣品濃度按提取物干燥品計，溶解制成10mg/ml溶液，于-20℃保存備用；分別編號為樣品1-5。

白蒜對照組：取白蒜1kg，按實施例3方法進行制備，得到白蒜多糖提取物，用斑馬魚培養液進行溶解，樣品濃度按提取物干燥品計，溶解制成10mg/ml溶液，于-20℃保存備用；編號為白蒜對照組。

空白對照組：以等體積的斑馬魚培養液替代作為空白對照組。

4.實驗方法和實驗結果

4.1毒性檢測

實驗方法：選擇狀態良好，受精后發育至48h血管轉基因斑馬魚胚胎，將其放入含1ml培養液的24孔培養板中，每孔8個胚胎，于28.5℃培養。以僅有斑馬魚培養液培養的胚胎為空白對照組，vri處理為模型組，以50、100、200、400μg/ml不同樣品作為處理組，觀察48h內胚胎存活情況。

實驗結果：各實施例400μg/ml樣品對斑馬魚胚胎毒性實驗結果如圖1所示。從實驗結果可以看出，樣品1-5和白蒜對照組處理48h后，斑馬魚胚胎數無變化、無病變，其他觀察濃度下樣品也均無毒性。

4.2樣品對斑馬魚血管生成影響

實驗方法：選擇狀態良好，受精后發育至48h血管轉基因斑馬魚胚胎，將其放入含1ml培養液的24孔培養板中，每孔8個胚胎，于28.5℃培養。以僅有斑馬魚培養液培養的胚胎為空白對照組，vri處理為模型組，以不同濃度(在考察的無毒濃度范圍內，<400μg/ml)樣品為藥物樣品處理組。藥物作用24h后，在熒光顯微鏡下觀察不同濃度樣品對斑馬魚節間血管(isvs)的影響，其中本發明定義在vri誘導的斑馬魚血管損傷模型中，從主動脈(da)發芽延伸并連接到背部脊索血管(dlavs)的isvs定義為完整血管(intact)，而未與dlavs相連的isvs定義為缺陷型血管(defective)，同時用imagej軟件(版本：1.51f)測量每條斑馬魚新生isvs的長度，每個實驗重復三次，結果以平均值±標準差(mean±sd)表示，并以t檢驗作顯著性分析。

實驗結果：斑馬魚節間血管完整與缺陷節間血管示意圖如圖2所示。實例1-5和白蒜對照組在200μg/ml濃度時對促斑馬魚血管生成作用如圖3所示。其實中實施例3在處理斑馬魚胚胎24h后，斑馬魚節間血管(isvs)長度和數量明顯增加(p＜0.05)，實施例3對斑馬魚節間血管(isvs)長度的結果如圖4所示，實施例3對斑馬魚節間血管(isvs)數量的結果如圖5所示。

從結果可以看出，白蒜對照組對斑馬魚isvs生成無影響，實施例1-5對有促斑馬魚血管生成作用，在處理斑馬魚胚胎24h后，isvs數量明顯增加。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。