一種納豆芽孢桿菌及其在發酵生產維生素k2中的應用的制作方法

一種納豆芽孢桿菌及其在發酵生產維生素k2中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種納豆芽孢桿菌，其分類命名為納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)，已保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC M 2014405。該菌種分離自市場上購買的納豆產品，后經紫外誘變篩選獲得，該菌種可高效利用大豆蛋白合成維生素K2；本發明還公開了利用上述納豆芽孢桿菌生產維生素K2油脂的方法。本發明采用新型供氧策略優化菌種發酵工藝，并進行發酵罐放大，最終維生素K2產量達到60.54mg/L，相對于大豆蛋白的轉化率為2.018mg/g，生產成本低。通過本發明方法可高效生產維生素K2油脂，整套工藝簡單，操作方便，生產周期短，維生素K2含量較高，降低了發酵成本，適合工業化生產。
CCTCC M 2014405
2014.09.09
【專利說明】一種納豆芽孢桿菌及其在發酵生產維生素K2中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種納豆芽孢桿菌及其在發酵生產維生素K2中的應用，屬于生物技 術領域。

【背景技術】
[0002] 維生素K2是一類脂溶性凝血類維生素，為甲萘醌類系列化合物，因其在食品中含 量極少，素有"鉬金維生素"之稱，在骨質疏松癥的預防和治療方面具有顯著的效果，被稱 為"第四代抗骨質疏松產品"。維生素K2的生物活性主要體現在促進凝血酶原的產生和增 加骨鈣素的合成上，在血液凝固以及骨骼代謝方面有重要作用，可用于治療和預防維生素K 缺乏引起的出血、動脈鈣化、骨關節炎及骨質疏松癥等疾病，在增加人體骨密度方面優于其 他維生素K。近年來，對其生理功能的研究和認識又進一步加深，維生素K2還可防止肝硬 化、肝纖維化轉化為肝癌，促進肝細胞再生，同時在預防和治療帕金森癥方面也具有一定的 療效。維生素K2作為人體內源性高活性維生素，其安全性已得到美國FDA、中國食品藥品監 督管理局、美國藥品研究所及歐洲議會和歐盟理事會的權威認定。
[0003] 維生素K2是一類化合物--甲基萘醌類化合物，根據其分子結構上C-3位異戊二 烯側鏈的長短不同共有14種形式，以MK-n表示（n指側鏈上異戊二烯單位的個數），甲萘 醌-4(MK-4)和甲萘醌-7(MK-7)最為常見，MK-4與維生素K1分子量相似，均具有很短的血 清半衰期，要實現血液循環需要很大的劑量，比MK-7推薦劑量高1000倍。而MK-7可快速 被腸道吸收，由大的脂質顆粒所運輸，在循環系統中停留很長時間，血液半衰期長，有能力 在除肝臟外的骨骼和動脈中發揮作用。
[0004] 以往維生素K2主要通過化學合成，而化學法合成的維生素K2其異戊二烯側鏈多 是順式結構，活性較低，而活性更高的天然維生素K2 (MK-7)僅能通過微生物發酵法獲得。 為滿足維生素K2不斷增長的市場需求、克服化學法來源維生素K2的缺點，近年來，科學工 作者開展了利用微生物發酵生產維生素K2的研究。主要包括利用納豆芽孢桿菌、黃桿菌 等，本發明所采用的菌種為納豆芽孢桿菌，用來制備MK-7型的維生素K2。納豆芽孢桿菌并 非分類學上的名稱，隸屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)。該菌為美國FDA公布的 40種益生菌之一，食用安全，是維生素K2生產的優良菌種，引起國內外學者的廣泛關注。
[0005]目前國內關于維生素K2制備的專利主要集中：（1)化學法合成；（2)微生物發酵 法；CN101605883B主要利用乳酸菌生產，CN201310521459. 1，CN103290077A主要利用黃桿 菌制備MK-4的維生素K2。而關于納豆芽孢桿菌的專利主要集中在：（1)固態發酵制備飼料 添加劑；（2)制備納豆激酶、合生素等功能性產品；僅兩篇與本專利有關，CN 102827798A公 開了一種可高產維生素K2的納豆芽孢桿菌，主要通過紫外、化學誘變以及原生質融合方法 提高菌種生長速率及VK2產量；CN103898175A也公開了一種納豆芽孢桿菌以及提純維生素 K2的方法，發明點主要在提純方法上，未提及維生素K2的發酵指標。以上專利沒有詳細研 究直接影響維生素K2積累的關鍵因素，導致產量不高，產業化難度較大。低的生產效率增 加了生產成本，致使微生物來源的維生素K2價格昂貴。維生素K2為胞內產物，生物量是高 產的關鍵，生物量的提高主要依賴營養元素的供應，而維生素K2的發酵原料成本主要來自 于氮源，大豆蛋白胨的價格70元/Kg，碳源甘油僅9元/Kg，因此，增加氮源對維生素K2的 轉化率是降低原料成本的關鍵。綜上，獲得維生素K2的高產菌株，并結合優良的發酵工藝， 獲得較高的生物量和維生素K2含量，并提高原料（特別是氮源）對維生素K2的轉化率，是 維生素K2的工業化推廣的關鍵所在。


【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是提供一種自主篩選的、能高產維生素K2的納豆芽 孢桿菌。
[0007] 本發明還要解決的技術問題是提供上述納豆芽孢桿菌在發酵生產維生素K2中的 應用。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：
[0009] 一種納豆芽孢桿菌，其分類命名為納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)，已保藏于中 國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC)，地址：中國武漢武漢大學，郵編：430072,其保藏編號 為CCTCC M 2014405,保藏日期為2014年9月9日。該納豆芽孢桿菌從江蘇省南京市市場 上購買的納豆產品中獲得，后經紫外誘變，篩選獲得蛋白酶活性較高菌種。
[0010] 通過該菌株發酵制備的維生素K2為MK-7型。
[0011]納豆芽孢桿菌CCTCC M 2014405菌株特性如下：
[0012] (1)菌落形態：將菌種稀釋涂布在固體培養基上，30-37°C培養，24h后，菌落表面 粗糙不透明，污白色或微黃色；
[0013] (2)菌體形態：在光學顯微鏡下觀察CCTCC M 2014405的形態及結構，菌體為桿 狀，單個細胞長〇. 5-3微米，革蘭氏陽性菌，好氧，含有芽孢，位于菌體中央或稍偏；
[0014] (3)液體培養：靜置培養表面會產生一層白色的生物膜，震蕩培養細胞生長速度 快，無白色膜；
[0015] (4)代謝：主要代謝產物為七烯甲基萘醌構型的維生素K2,該菌株在25-40°C均能 生長，其中30-37°C為最適生長溫度；菌體適合在中性pH培養液中生長。
[0016](5)胞外酶：可產生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等，可分解胞外含氮原料，如大豆 粉、菌渣等。
[0017] 通過形態及培養特性判定本菌為芽孢菌屬的微生物，為進一步對所獲得的菌株進 行鑒定，借用分子生物學手段對其16SRNA序列（如SEQ ID N〇:l所示）進行比對。發現本 菌與8&(^11118 8油^118的1651?嫩序列存在96%的同源性，因此判定本菌株屬于芽孢桿 菌，命名為 Bacillus natto R127。
[0018] 上述納豆芽孢桿菌在發酵生產維生素K2中的應用。
[0019] 其中，所述的維生素K2為MK-7型。
[0020] 具體的發酵生發方法為，CCTCC M 2014405菌株為出發菌株，在液體培養基中進行 高密度發酵，分別對收集的細胞和濾液進行提取獲得富含維生素K2的油脂。
[0021] 其中，所述的高密度發酵，包括如下步驟：
[0022] (1)將保存在甘油管的菌株接入固體培養基中進行菌種活化，37°C培養箱中培養， 20?28h，連續活化兩代；
[0023] (2)利用滅菌后的生理鹽水將斜面上的菌洗下，接入裝有50mL種子培養基的 250mL搖瓶中，在30?37°C的搖床中，以120?200rpm的轉速，培養24?48h，獲得一級種 子液；
[0024] (3)將一級種子接入裝有100mL種子培養基的500mL搖瓶中，接種量2?10% (v/ v)在30?37°C的搖床中，以160?250rpm的轉速，培養18?24h，獲得二級種子液；
[0025] (4)將二級種子接入裝有發酵培養基的發酵罐中，接種量2?10% (v/v)，加入消 泡劑，通氣量0. 2?2vvm，攪拌轉速200?600rpm，罐溫30?37°C，培養64?96h，發酵生 產維生素K2。
[0026] 步驟（1)、（2)或（3)中，所述的固體培養基配方為：30g/L葡萄糖，40g/L蛋白胨， 5g/L NaCl，5g/L牛肉膏，5g/L酵母膏，30g/L瓊脂，溶劑為水。種子培養基配方為10-50g/ L葡萄糖，20-80g/L蛋白胨，2-10g/L NaCl，2-10g/L牛肉膏，2-10g/L酵母膏，溶劑為水。種 子培養基優選配方為：30g/L葡萄糖，40g/L蛋白胨，5g/L NaCl，5g/L牛肉膏，5g/L酵母膏， 溶劑為水。發酵培養基配方為30-80g/L甘油，20-100g/L大豆蛋白胨，0. 2-1. 5g/L酵母粉， 0. l-lg/LK2HP04,0. l-lg/LCaCl2 ?%0,0. l-lg/LMgS04 *7H20,溶劑為水。發酵培養基優選配方 為：50g/L 甘油，30g/L 大豆蛋白胨，0? 6g/L 酵母粉，0? 3g/LK2HP04,0. lg/LCaCl2 ? H20,0. 3g/ LMgS04 ? 7H20,溶劑為水。
[0027] 步驟（4)中，所述的消泡劑為silicone SE-2,使用量為0?2_3g/L，優選0?3g/L。
[0028] 步驟（4)中，發酵罐中發酵產維生素K2油脂采用間歇式發酵或補料式發酵方法。
[0029] 步驟（4)中，發酵罐采用養魚用的氣石（微孔分布器）作為氣體分布器。
[0030] 其中，所述的提取，包括如下步驟：
[0031] (I)經微濾設備濃縮發酵液，獲得濃縮后的菌體細胞，細胞密度高于l〇〇g/L，均質 機機械破碎；
[0032] (II)濾液進行納濾，截留分泌至胞外的維生素K2 ;
[0033] (III)將步驟（I)和（II)所得破碎細胞和截留液加有機溶劑攪拌，萃取；
[0034] (IV)將有機溶劑減壓蒸發，獲得富含維生素K2油脂。
[0035] 步驟（III)中，所述的有機溶劑為正己烷、石油醚、乙醇、異丙醇和乙醚中的任意 一種或幾種的混合，優選異丙醇和正己烷按體積比1 :〇. 5?2的混合物。
[0036] 通過本發明方法生產維生素K2,最終維生素K2的含量達58. 64mg/L，相對于大豆 蛋白胨的轉化率為1.955mg/g。
[0037] 本發明所采取的工藝方法同樣適用于納豆芽孢桿菌同均屬的其他菌株以及在此 基礎上進行誘變獲得的菌種，如Bacillus subtilis CICC10262、Bacillus subtilis CGMCC NO. 8400 等，最適的菌種為 CCTCC M 2014405。
[0038] 有益效果：本發明從自主篩選的菌株CCTCC M 2014405出發，在詳細研究菌種生 長特性基礎上，采用新型供氧策略優化發酵過程，利用養魚所用的氣石作為發酵罐氣體分 布器，強化供氧效果，進而提供了一種高效生產維生素K2的方法，并適合大規模生產，最 終維生素K2的含量達58. 64mg/L，相對于大豆蛋白胨的轉化率為1. 955mg/g，生產成本較 低。同時，本發明還提供了一種從納豆芽孢桿菌中提取維生素K2油脂的方法，提取收率在 90-95%左右。整套工藝簡單，操作方便，發酵過程轉速低于300rpm，能耗較低，降低了發酵 成本，適合工業化生產。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 圖1為發酵樣品液相圖譜。
[0040] 圖2為發酵樣品維生素K2 (MK-7)質譜圖。

【具體實施方式】
[0041] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發明。
[0042] 實施例1 :菌株篩選
[0043] 取lg納豆產品溶解于100ml生理鹽水中，振蕩混合均勻，將樣品懸液按照每級稀 釋10倍的次序制得lO-i-lO- 7個濃度，分別將1〇_3-1〇-7五個濃度中吸取100U1稀釋液加到 篩選培養基中涂布，每個濃度涂三塊板，37 °C，培養48h，挑選可產生水解圈且較大的菌落， 繼續在篩選培養基中劃線，獲得純菌，經發酵復篩，高效液相分析及質譜鑒定，獲得可產維 生素K2的菌種Bacillus natto R，且該菌株所產維生素K2為MK-7構型（如圖1，2)。
[0044] 為提高菌種分解蛋白的能力，對所得Bacillus natto R進行誘變篩選：將活化 后的菌液用生理鹽水洗滌，將菌懸液在紫外燈下照射，照射距離30cm，每隔20s取樣，最后 選擇180s，致死率在80%左右的條件進行誘變篩選，所得誘變菌液稀釋涂布在篩選培養基 中，篩選透明圈較大的菌株，命名為Bacillus natto R127,保藏于中國典型微生物菌種保 藏中心，其保藏編號為CCTCC M 2014405。
[0045] 篩選培養基為：4g干酪素溶于100ml水中，115°C滅菌20min，牛肉膏3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，瓊脂20g，溶于900ml水中，121 °C，滅菌20min，冷卻至50°C左右，將兩者混合， 倒平板待用。
[0046] HPLC方法：色譜柱：C18柱，柱溫：50°C，流動相：甲醇，流速：lml/min，紫外檢測波 長270nm，進樣量：30ul，檢測時間：35min。
[0047] 實施例2:菌株基本生長性能考察。
[0048] 對篩選獲得的菌株CCTCC M 2014405進行基本性能考察，采用不同液體種子培養 基進行培養，考察細胞生長速率，結果如表1，所用培養基為（％表示每l〇〇ml培養基中含有 物質的質量g):
[0049] 培養基1:10〇1^豆芽汁，5%蔗糖
[0050] 培養基2 :1%葡萄糖，1%蛋白胨，0? 5% NaCl
[0051] 培養基3 :3%葡萄糖，4%蛋白胨，0. 5% NaCl，0. 5%牛肉膏，0. 5%酵母膏
[0052] 培養基4 :0. 5%葡萄糖，1%蛋白胨，0. 5% NaCl，0. 5%牛肉膏，0. 5%酵母膏
[0053] 表1不同種子培養基菌體生長情況表
[0054]

【權利要求】
1. 一種納豆芽孢桿菌，其分類命名為納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)，已保藏于中國 典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC M 2014405,保藏日期為2014年9月9日。
2. 權利要求1所述的納豆芽孢桿菌在發酵生產維生素K2中的應用。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的維生素K2為MK-7型。
4. 根據權利要求2或3所述的應用，其特征在于，CCTCC M 2014405菌株為出發菌株， 在液體培養基中進行高密度發酵，分別對收集的細胞和濾液進行提取獲得富含維生素K2 的油脂。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的高密度發酵，包括如下步驟： (1) 將保存在甘油管的菌株接入固體培養基中進行菌種活化，37°C培養箱中培養， 20?28h，連續活化兩代； (2) 利用滅菌后的生理鹽水將斜面上的菌洗下，接入裝有50mL種子培養基的250mL搖 瓶中，在30?37°C的搖床中，以120?200rpm的轉速，培養24?48h，獲得一級種子液； (3) 將一級種子接入裝有100mL種子培養基的500mL搖瓶中，接種量2?10 % (v/v) 在30?37°C的搖床中，以160?250rpm的轉速，培養18?24h，獲得二級種子液； (4) 將二級種子接入裝有發酵培養基的發酵罐中，接種量2?10 % (v/v)，加入消泡劑， 通氣量0. 2?2vvm，攪拌轉速200?600rpm，罐溫30?37°C，培養64?96h，發酵生產維 生素K2。
6. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的固體培養基配方為30g/L葡萄糖， 40g/L蛋白胨，5g/LNaCl，5g/L牛肉膏，5g/L酵母膏，30g/L瓊脂，溶劑為水；種子培養基配 方為 10-50g/L 葡萄糖，20-80g/L 蛋白胨，2-10g/L NaCl，2-10g/L 牛肉膏，2-10g/L 酵母膏， 溶劑為水；發酵培養基配方為30-80g/L甘油，20-100g/L大豆蛋白胨，0. 2-1. 5g/L酵母粉， 0? l-lg/LK2HP04,0. l-lg/LCaCl2 ? H20,0. l-lg/LMgS04 ? 7H20,溶劑為水。
7. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，步驟⑷中，所述的消泡劑為 siliconeSE-2,使用量為 0? 2-3g/L。
8. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，步驟（4)中，發酵罐中發酵產維生素K2油 脂采用間歇式發酵或補料式發酵方法；發酵罐采用微孔分布器作為發酵罐的氣體分布器。
9. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的提取，包括如下步驟： (I) 經微濾設備濃縮發酵液，獲得濃縮后的菌體細胞，細胞密度高于l〇〇g/L，均質機機 械破碎； (II) 濾液進行納濾，截留分泌至胞外的維生素K2 ; (III) 將步驟（I)和（II)所得破碎細胞和截留液加有機溶劑攪拌，萃取； (IV) 將有機溶劑減壓蒸發，獲得富含維生素K2油脂。
10. 根據權利要求9所述的應用，其特征在于，步驟（III)中，所述的有機溶劑為正己 烷、石油醚、乙醇、異丙醇和乙醚中的任意一種或幾種的混合。
【文檔編號】C12P7/66GK104328064SQ201410472873
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月16日 優先權日:2014年9月16日
【發明者】黃和, 邱宏偉, 任路靜, 王星麗 申請人:麗水雙健生物工程有限公司