優化多粘芽孢桿菌發酵液中e1和e2組分比例的方法
【專利摘要】優化多粘芽孢桿菌發酵液中E1和E2組分比例的方法，步驟如下：a、斜面培養；b、種子液培養；c、發酵培養；d、發酵液中E1和E2組分檢測。本發明解決了多粘菌素E發酵液中E1和E2組分比例不穩定性和不可控性的問題。
【專利說明】優化多粘芽孢桿菌發酵液中E1和E2組分比例的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物【技術領域】，具體涉及優化多粘芽孢桿菌發酵液中El和E2組分比例的方法。
【背景技術】
[0002]多粘菌素E是由多粘類芽胞桿菌產生的，由多種氨基酸和脂肪酸組成的一種堿性多肽類抗生素，多粘菌素E對革蘭氏陰性菌的作用最強，無論生長期還是靜止期的細胞均能很快被殺死，它可以治療由志賀氏痢疾菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌屬和普通變形桿菌引起的感染，并對霍亂弧菌、鼠疫桿菌等也有很好的作用。由于多粘菌素E具有良好的抗菌活力和高效，低毒，殘留少的特性，可用于飼料添加劑，促進禽畜生長和提高飼料利用率，并且可以防止飼料大規模生產中常出現的由大腸埃希氏菌和沙門氏菌污染引起的疾病。
[0003]多粘菌素E主要成分為多粘菌素El和E2，多粘菌素E主要的獲得方法就是發酵法，而多粘菌素E發酵液中El和E2組分比例的不穩定性和不可控性一直是困擾多粘菌素E發酵行業的一個問題，因此有必要發明一種實施簡單，工藝可行的方法來解決這一問題。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是解決多粘菌素E發酵液中El和E2組分比例的不穩定性和不可控性的問題。
[0005]本發明為實現其目的采用的技術方案是:
[0006]優化多粘芽孢桿菌發酵液中El和E2組分比例的方法，包括以下操作步驟:
[0007]a、斜面培養:將多粘菌素生產菌株砂土孢子接種于斜面培養基中，于溫度28-30°C、濕度30% -60%的條件下培養48_72h ；
[0008]b、種子液培養:挖取2-5cm2步驟a制備的斜面孢子接種于種瓶培養基中，于溫度28-30°C、濕度30% -60%、轉速180_220rpm的條件下震蕩培養24_26h ；
[0009]c、發酵培養:將步驟b培養成熟的種子液按2%的接種量接入發酵培養基中，于溫度28-30°C、濕度30% -60%、轉速180_220rpm的條件下震蕩培養48_72h ;在發酵培養24h-32h按不同配比加入纈氨酸和異亮氨酸繼續培養；
[0010]d、發酵液中El和E2組分檢測:將步驟c培養48_72h后得到的多粘菌素E發酵液中El和E2組分的含量進行檢測。
[0011]步驟a中所用的斜面培養基成分及其含量為:以質量百分比計，葡萄糖1% -1.5 %、硫酸銨1% -1.5 %、檸檬酸鈉1% -1.5 %、磷酸二氫鉀1% -1.5 %、硫酸鎂0.12% -1.13%、瓊脂 2% -2.5%o
[0012]步驟b中所用的種子液培養基成分及其含量為:以質量百分比計，葡萄糖
2.0% -2.5 %、蛋白胨 1.5% -2.0 %、氯化鈉 0.2% -0.3 %、碳酸鈣 0.4 % -0.5 %、泡敵0.04% -0.05%。[0013]步驟c中所用的發酵培養基的成分及其含量為:以質量百分比計，玉米淀粉
6.0-8.0 %、葡萄糖 1.0% -1.5 %、蛋白胨 1.5% -2.0 %、碳酸鈣 0.4 % -0.5 %、氯化鈉
0.1% -0.2%、硫酸銨 0.1% -0.2%、磷酸二氫鉀 1% -1.5%、泡敵 0.04% -0.05%。
[0014]步驟c中不同纈氨酸和異亮氨酸的配比包括以下三種情況:
[0015]1、E2組分:E1組分≥2:1，添加纈氨酸使其在發酵液中的終濃度為:0.8mg/mL-Ι.6mg/mL,同時添加異亮氨酸使其在發酵液中的終濃度為:0mg/mL-0.lmg/mL。
[0016]IK2:1>E2組分:E1組分>1: 1，添加纈氨酸使其在發酵液中的終濃度為:0.3mg/mL-0.8mg/mL,同時添加異亮氨酸使其在發酵液中的終濃度為:0.lmg/mL-Ο.3mg/mL。
[0017]II1、E2組分:E1組分≤1:1，添加纈氨酸使其在發酵液中的終濃度為:0mg/mL-Ι.2mg/mL,同時添加異亮氨酸使其在發酵液中的終濃度為:0.3mg/mL-l.5mg/mL。
[0018]本發明的有益效果是:本發明研究的這種優化多粘菌素E發酵液中El和E2組分的方法解決了多粘菌素E發酵液中El和E2組分比例不穩定性和不可控性的問題，而且本發明具有方法簡單、實用性強、重現性好的優點。【具體實施方式】
[0019]本發明的目的是解決多粘菌素E發酵液中El和E2組分的不穩定性和比例的不可控性的問題，下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。 [0020]具體實施例1，E2組分:E1組分≥2:1的情況
[0021]a、斜面培養:將多粘菌素生產菌株砂土孢子接種于斜面培養基中，于溫度28-30°C、濕度30% -60%的條件下培養60h ；
[0022]b、種子液培養:挖取2-5cm2步驟a制備的斜面孢子接種于種瓶培養基中，于溫度28-30°C、濕度30% -60%、轉速180_220rpm的條件下震蕩培養25h ；
[0023]c、發酵培養:將步驟b培養成熟的種子液按2%的接種量接入發酵培養基中，每個種子做4個平行樣，于溫度28-30°C、濕度30% -60%、轉速180_220rpm的條件下震蕩培養60h ;發酵25h后加入纈氨酸使其在發酵培養基中的終濃度為0.954mg/mL,同時加入異亮氨酸使其在發酵培養基中的終濃度為0.015mg/mL繼續震蕩培養；
[0024]d、發酵液中El和E2組分檢測:將步驟c培養60h后得到的多粘菌素E發酵液中El和E2組分的含量進行檢測。
[0025]檢測結果見表1
[0026]表1 60h發酵樣品檢測結果
[0027]
【權利要求】
1.優化多粘芽孢桿菌發酵液中El和E2組分比例的方法，其特征在于，包括以下操作步驟: a、 斜面培養:將多粘菌素生產菌株砂土孢子接種于斜面培養基中，于溫度28-30°C、濕度30% -60%的條件下培養48-72h ； b、種子液培養:挖取2-5cm2步驟a制備的斜面孢子接種于種瓶培養基中，于溫度28-30°C、濕度30% -60%、轉速180_220rpm的條件下震蕩培養24_26h ； C、發酵培養:將步驟b培養成熟的種子液按2%的接種量接入發酵培養基中，于溫度28-30°C、濕度30% -60%、轉速180_220rpm的條件下震蕩培養48_72h ;在發酵培養24h-32h按不同配比加入纈氨酸和異亮氨酸繼續培養； d、發酵液中El和E2組分檢測:將步驟c培養48-72h后得到的多粘菌素E發酵液中El和E2組分的含量進行檢測。
2.根據權利要求1所述的優化多粘芽孢桿菌發酵液中El和E2組分比例的方法，其特征在于，步驟a中所用的斜面培養基成分及其含量為:以質量百分比計，葡萄糖I % -1.5 %、硫酸銨1% -1.5%、檸檬酸鈉1% -1.5%、磷酸二氫鉀1% -1.5%、硫酸鎂0.12% -1.13%,瓊脂 2% -2.5%。
3.根據權利要求1所述的優化多粘芽孢桿菌發酵液中El和E2組分比例的方法，其特征在于，步驟b中所用的種子液培養基成分及其含量為:以質量百分比計，葡萄糖2.0% -2.5 %、蛋白胨 1.5% -2.0 %、氯化鈉 0.2% -0.3 %、碳酸鈣 0.4% -0.5 %、泡敵0.04% -0.05%。
4.根據權利要求1所述的優化多粘芽孢桿菌發酵液中El和E2組分比例的方法，其特征在于，步驟c中所用的發酵培養基的成分及其含量為:以質量百分比計，玉米淀粉6.0-8.0%、葡萄糖L0% -1.5%、蛋白胨L 5% -2.0 %、碳酸鈣0.4 % _0.5%、氯化鈉0.1% -0.2%、硫酸銨 0.1% -0.2%、磷酸二氫鉀 1% -1.5%、泡敵 0.04% -0.05%。
5.根據權利要求1所述的優化多粘芽孢桿菌發酵液中El和E2組分比例的方法，其特征在于，步驟c中纈氨酸和異亮氨酸的配比包括以下三種情況: I、E2組分:E1組分≥2:1，添加纈氨酸使其在發酵液中的終濃度為:0.8mg/mL-l.6mg/mL,同時添加異亮氨酸使其在發酵液中的終濃度為:0mg/mL-0.lmg/mL。 Π、2:1>Ε2組分:E1組分>1:1，添加纈氨酸使其在發酵液中的終濃度為:0.3mg/mL-Ο.8mg/mL,同時添加異亮氨酸使其在發酵液中的終濃度為:0.lmg/mL-Ο.3mg/mL。 II1、E2組分:E1組分≤1:1，添加纈氨酸使其在發酵液中的終濃度為:0mg/mL-l.2mg/mL,同時添加異亮氨酸使其在發酵液中的終濃度為:0.3mg/mL-l.5mg/mL。
【文檔編號】C12P21/04GK103993059SQ201410230742
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月28日 優先權日:2014年5月28日
【發明者】賈曉樂 申請人:河北圣雪大成制藥有限責任公司