包含嵌合巨細胞病毒啟動子和增強子序列的表達載體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及哺乳動物表達系統，以及尤其涉及用于在哺乳動物細胞中異源表達感 興趣的核酸序列的包含嵌合啟動子調控序列的表達構建體。嵌合啟動子調控序列由源自鼠 或人巨細胞病毒的啟動子序列和源自人和/或猴巨細胞病毒的上游區和/或增強子序列組 成，只要該序列元件源自至少兩種不同的巨細胞病毒種。
【背景技術】
[0002] 使用包括原核和真核細胞的各種遺傳工程改造的有機體生產用于基礎研宄、診斷 和治療應用的重組（多）肽和蛋白，如抗體分子、疫苗、激素和生長因子。然而，絕大多數的 重組肽或蛋白涉及翻譯后修飾，當使用原核宿主細胞時翻譯后修飾不能被模擬或再造。出 于這個原因，已證明哺乳動物基因表達系統代表了一個優選的選擇。
[0003] 基于中國倉鼠卵巢（CHO)細胞的哺乳動物表達系統被廣泛地應用在重組蛋白生 產中。除了淋巴細胞系，CHO細胞代表一些細胞類型中的一種，這些細胞類型允許簡單有效 的高密度懸浮分批培養動物細胞。此外，使用CHO細胞導致高的產物產量，而淋巴細胞更難 于以工業規模培養。鑒于重組生產多肽和蛋白可觀的成本，將每生物反應器運行的重組蛋 白產量最大化同樣至關重要。那些對產物產量有相當大影響的過程參數包括尤其是細胞 培養條件、待表達的核酸（基因）的拷貝數、這些基因被轉錄和相應的mRNA被翻譯的效率、 mRNA穩定性等。
[0004] 因此，控制基因表達的調控遺傳元件的強度或轉錄活性的改進構成了為增加所生 產的重組蛋白產量特別關鍵的因素。即使是轉錄活性在單細胞水平上小的增量增加將最終 轉化為高密度工業規模分批培養中產物產量相當大的改善。
[0005] 哺乳動物基因表達系統的絕大多數使用在源自病毒的啟動子調控序列控制下編 碼待表達的異源核酸序列的表達載體。在這些表達盒中兩個最常用的病毒調控元件是人巨 細胞病毒（hCMV)即早期基因1和2 (IE1和IE2)的那些。然而，與使用hCMV IEl和IE2調 控元件相關聯的一個缺點是它們顯著的物種特異性。
[0006] 美國專利5, 866, 359公開可通過在弱啟動子的控制下共表達腺病毒ElA蛋白改善 來自此類hCMV啟動子的基因表達。ElA是一種多功能轉錄因子，它可以作用于細胞周期調 控，并且具有獨立的轉錄激活和抑制功能結構域二者。ElA表達的微調對于實現基因反式激 活和對細胞周期進展的任何負面影響之間理想平衡是重要的。然而，ElA表達的過表達可 降低細胞合成感興趣的重組蛋白的能力。
[0007] 美國專利5, 591，639描述了表達載體，其包含待表達的異源核酸序列的上游 (5'）、增強子、啟動子和含有內含子A(即第一天然內含子）的人巨細胞病毒（hCMV-MIE) 主要即早期基因的完整5'非翻譯區。然而，如果存在該序列（約2100bp的總長度）的前 400bp (5' -端），則在C0S7和CHO兩種細胞中觀察到不良的基因表達率（Chapman, B. S等人 (1991)Nucl. Acids Res. 19, 3979-3986)。
[0008] 鼠巨細胞病毒（mCMV)即早期基因調控元件的轉錄活性高于hCMV對應部分的轉 錄活性，而不表現出人序列所觀察到的明顯物種偏好（Addison, C. L等人（1987) J. Gen. Virol. 78, 1653-1661)。
[0009] 然而，試圖通過插入mCMV IE啟動子下游（3'）的鼠主要即早期基因的天然第一內 含子來提高mCMV IE啟動子調控元件（類似于hCMV的對應部分）活性的嘗試失敗了（尤 其參考歐洲專利1 525 320 BI)。然而，產生包含嵌合盒的表達載體導致和使用完整人序列 時不相上下的產物產量，其中嵌合盒由mCMV IEl的調控元件和人主要即早期基因的天然第 一內含子組成（參見，例如WO 2006/111387A2)。對于包含mCMV IE2調控序列的表達載體 也獲得了類似的基因表達率（尤其參見EP專利1 601 776 BI)。
[0010] 因此，仍然需要產生高產量的所生產的重組多肽或蛋白的改善的哺乳動物基因表 達系統。特別是，需要克服上述局限性的哺乳動物基因表達系統，即這樣的表達系統基于所 述mCMV或hCMV啟動子序列，但是比現有系統實現更高的表達率（以及因此，產物產量）。
[0011] 因此，本發明的一個目的是提供這樣的基因表達系統，主要是適合的表達構建體 和相應的哺乳動物宿主細胞。
【發明內容】
[0012] 一方面，本發明涉及一種用于在哺乳動物細胞中異源表達感興趣的核酸序列的表 達載體，所述載體包含可操作地連接至第一待表達的核酸序列的第一嵌合啟動子調控序 列，其中所述嵌合啟動子調控序列包含：
[0013] (i)啟動子序列，其源自鼠巨細胞病毒或源自人巨細胞病毒，并且可操作地連接至 待表達的核酸序列的轉錄起始位點；以及
[0014] (ii)上游區和/或增強子序列，其源自人和/或猴巨細胞病毒，其中所述上游區和 /或增強子序列位于鼠或人啟動子序列的5'并且可操作地連接至鼠或人啟動子序列；并且
[0015] 其中所述嵌合啟動子調控序列包含源自鼠巨細胞病毒、人巨細胞病毒和猴巨細胞 病毒中至少兩種的序列元件。
[0016] 在具體的實施方式中，啟動子序列源自鼠巨細胞病毒IEl啟動子；和/或上游區和 /或增強子序列源自人和/或猴巨細胞病毒IEl增強子。
[0017] 在優選的實施方式中，鼠巨細胞病毒IEl啟動子序列具有SEQ ID NO :4的核苷酸 序列。
[0018] 在其它【具體實施方式】中，啟動子序列源自人巨細胞病毒IEl啟動子；和/或上游區 和/或增強子序列源自人和/或猴巨細胞病毒IEl增強子。
[0019] 在優選的實施方式中，人巨細胞病毒IEl啟動子序列具有SEQ ID NO :5的核苷酸 序列。
[0020] 在其它優選實施方式中，上游區和/或增強子序列包含源自猴巨細胞病毒IEl區 的SEQ ID NO :6的核苷酸序列。
[0021] 在尤其優選的實施方式中，嵌合啟動子調控序列包含選自SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO :12 和 SEQ ID NO : 13 的核 苷酸序列。
[0022] 在其它具體的實施方式中，表達載體還包含可操作地連接至第二待表達的核酸序 列的第二嵌合啟動子調控序列，其中第二嵌合啟動子調控序列和第一嵌合啟動子調控序列 相同。
[0023] 在替代的【具體實施方式】中，表達載體還包含可操作地連接至第二待表達的核酸序 列的第二嵌合啟動子調控序列，其中第二嵌合啟動子調控序列和第一嵌合啟動子調控序列 不同。
[0024] 優選地，所述第一和第二待表達的核酸序列編碼不同的多肽。在具體的實施方式 中，不同的多肽代表二聚體或多聚體蛋白的亞基。尤其優選地，所述二聚體或多聚體蛋白是 抗體分子。
[0025] 另一方面，本發明涉及一種哺乳動物宿主細胞，其轉染有本文上述所限定的表達 載體。優選地，所述宿主細胞是CHO細胞。
[0026] 又一方面，本發明涉及一種用于在哺乳動物宿主細胞中異源表達感興趣的核酸序 列的方法，其包括：
[0027] ⑴用本文上述所限定的表達載體轉染哺乳動物宿主細胞；以及
[0028] (ii)在允許表達所述感興趣的核酸序列的條件下培養轉染的哺乳動物宿主細胞。
[0029] 在優選的實施方式中，轉染是穩定的轉染。
[0030] 另一方面，本發明涉及本文上述所限定的表達載體用于在哺乳動物宿主細胞中異 源表達感興趣的核酸序列的用途。
[0031] 本發明的其它實施方式將通過如下詳細的描述變得明顯。
【附圖說明】
[0032] 圖1表示用作"親本載體"用來產生本文所限定的哺乳動物表達載體的表達載體 pRY42(SEQ ID NO:l)。pRY42包含兩個用于驅動異源基因表達的調控盒（分別在"mCMV" 和"pA"之間）：位于"Ex2"區3'（Sr下游"）的多克隆位點用于插入待表達的異源核酸序 列。調控盒兩側是突變（"F5-mFRT"）和野生型（"wFRT"）翻轉酶識別靶位點。框內起始 蛋氨酸密碼子已被添加到wFRT位點的5'端（"ATG+F"）。SV40早期啟動子（"SV"）位于 ATG+F的5'（ "上游"）。異源核酸序列的轉錄由鼠巨細胞病毒IEl基因（"mCMV"）的啟動 子驅動，鼠巨細胞病毒IEl基因的啟動子之后是5'UTR，其中外顯子I ( "Exl"）是鼠（"m"） 和人（"h"）CMV衍生序列的雜交體，并且其中外顯子2( "Ex2"）和內含子A序列（"Int A"）源自hCMV序列。β內酰胺酶選擇標記基因被表示為"bla"。pRY42被用作靶載體用于 克隆本文所限定的不同嵌合啟動子調控序列。
[0033] 圖2表示編碼鼠人嵌合單克隆抗體（mAb)cB72. 3的輕（"LC"）和重（"HC"）鏈 的表達載體 pRY57(SEQ ID NO :2) (Whittle, N 等人（1987) Protein Eng. 1,499-505)，LC 和 HC分別位于"Ex2"區的3'克隆位點和聚腺苷酸化位點（"pA"）之間。其他方面，pRY57 和PRY42相同。除去pRY57的LC和HC核酸序列并將其克隆到pRY42變體中，在其中原始 的mCMV啟動子序列被替換為本文所限定的不同嵌合啟動子調控序列。
[0034] 圖3示意性描繪包含在pRY42 (上部）中的原始mCMV啟動子序列（SEQ ID NO :3) 以及如本文所限定的5個不同的嵌合啟動子調控序列（構建體"1至5"）（分別為SEQ ID NO :7至SEQ ID NO : 11)，其包含位于源自猴（sCMV)和/或人（hCMV) CMV的上游區和/或增 強子元件3'的鼠 CMV(mCMV)啟動子序列。此外，顯示了如本文所限定的兩個額外的嵌合啟 動子調控序列（構建體"6和7"）（SEQ ID NO :12和SEQ ID NO :13)，其包含位于源自sCMV 和/或人hCMV的上游區和/或增強子元件3'的hCMV啟動子序列。本文所特異性使用的 所有mCMV和hCMV啟動子序列在它們的3' -末端包含額外的鳥嘌呤（"G"）核苷酸，其代表 轉錄起始位點。
[0035] 圖4顯示在穩定的CHO系生產的mAb cB72. 3的濃度比較，其中所述mAb序列的 基因表達在嵌合構建體1至5的控制下，如圖3所示。使用補料分批過生長（FOG)規程在 E250搖瓶培養中的50ml生長介質中生長15天后，通過Protein A HPLC進行測定。對于每 一個嵌合構建體，η = 4,這代表重復補料分批分析用于一式兩份的轉染，構建體4例外，其 中η = 6 (重復FOG分析用于一式三份的轉染），以及pRY57 (原始mCMV)，其中η = 8,組合 實驗1和2中的數據點。
[0036] 圖5顯示在穩定的CHO系生產的mAb CB72.3的濃度比較，其中所述mAb序列的基 因表達在嵌合構建體6和7的控制下，如圖3所示。使用分批過生長（BOG)規程在Ε125搖 瓶培養中的30ml生長介