一種植物花粉特異性啟動子pchf32及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物分子生物學領域，具體涉及一種植物花粉特異性啟動子PCHF32 及其應用。
【背景技術】
[0002] 在基因的結構與功能研宄中，轉錄水平的調控是一個關鍵步驟，基因轉錄起始是 一系列反式作用因子和轉錄位點共同作用的結果。編碼蛋白質的基因包含啟動子和編碼 區，啟動子一般位于編碼區上游，是反式作用因子的結合位點，有兩個主要區域：核心啟動 子區域和轉錄調控區域。核心啟動子是轉錄起始的最短啟動子片段，一般為40nt，包含核 心啟動子元件，是一段被RNA聚合酶家族I、II和III識別和結合的DNA序列。轉錄調控 區域位于核心啟動子的上游（或下游），可與特異的轉錄因子相結合從而對轉錄的時空、強 弱起調控作用，如增強子和沉默子等。啟動子具有如下特征：1)序列特異性。啟動子含有 保守的序列框，序列框中堿基的變化會影響轉錄水平。2)方向特異性。啟動子是一種有方 向性的順式調控因子，分單向啟動子和雙向啟動子兩類。3)位置特異性。啟動子一般位于 基因編碼區或功能區的上游。4)種屬特異性。不同物種具有不同類型的啟動子。5)功能 特異性。不同組織和不同生化途徑具有不同類型的啟動子。核心啟動子經典保守序列有 以下四種：1)轉錄起始位點（initiator, Inr)。通常位于翻譯起始密碼子（AUG)上游-40 到-70bp處。轉錄起始位點并無十分嚴格的同源順序，常見的保守序列是處于+1的A和+3 的T。TFIID和TFII-I等轉錄因子可識別轉錄起始位點并啟動轉錄。2) TATA box。是核心 元件，是RNA聚合酶II的識別位點，也是與一些反式作用因子結合的位點之一。植物啟動 子的TATA box -般位于轉錄起始點上游32±7bp處，其保守序列為5'T37C42A38C 47T96A97T9QA94 T53A95T63A71G413'。TATA box通過與轉錄因子TFIID的識別結合而決定RNA聚合酶起始轉錄的 位點，形成前轉錄復合物并起動轉錄。TATA box還決定轉錄的方向以及介導上下游元件對 轉錄的調控作用。3)CAAT box，是一種增強轉錄的元件。一般位于轉錄起始點的-75bp附 近，其保守序列為GGC/TCAATCT。CAAT box與控制轉錄起始頻率有關。4) GC box，通常位于 轉錄起始點的_90bp附近，其保守序列為GGGCGG，可有多個拷貝，須與轉錄因子SPl互作才 能促進基因轉錄。
[0003] 啟動子按其表達方式可分為三類：組成型啟動子、誘導型啟動子和組織特異性啟 動子。組成型啟動子在生物體各個發育時期和所有的組織中都啟動基因表達，具有時空持 續性和表達量恒定性。大多數組成型啟動子中存在六聚體TGACTG，位于轉錄起始位點上游 IOObp左右，并往往重復出現。誘導型啟動子能在某些物理或化學信號的誘導下啟動基因表 達，或可以大幅度地提高基因的轉錄水平。它們具增強子、沉默子或類似功能的序列結構， 并有明顯的專一性。一部分誘導型啟動子同時具組織特異性，該類啟動子常以誘導信號命 名，如光誘導啟動子、熱誘導啟動子、低溫誘導啟動子、干旱誘導啟動子、創傷誘導啟動子、 激素誘導啟動子等。組織特異性表達啟動子只在某種細胞、組織或者器官中啟動基因表達。 其結構上通常存在組織特異性增強子和沉默子，因而調控基因在特定的組織或器官中的轉 錄水平。這些啟動子還往往表現出化學物理信號誘導性，還受到組織細胞生理狀態以及發 育階段的影響。這種類型的啟動子有根特異性啟動子、維管束特異性啟動子、莖桿和葉片特 異性啟動子、花特異性啟動子、種子和果實特異性啟動子等。
[0004] 隨著大量DNA序列的積累和各種基因數據庫的建立，有關啟動子的預測及鑒定 和分析的計算機軟件和網站也相繼產生，如GENESCAN(http://genes. mit. edu/GENSCAN. html)，GENEFINDER(http://rulai.cshl.edu/tools/genefinder/)，PROMOTER SCAN(ver I. 7http://bimas. dcrt. nih. gov/molbio/proscan), TESS(http://searchlauncher, bcm. tmc. edu/seq-search/gene-search. html), Match (http://www.generegulation. com/ cgi-bin/pub/programs/match/match. cgi)，AliBata 2. I (http://www. gene-regulation. com/pub/programs/alibaba2/index, html), ppdb(plant promoter database, http:// www.ppdb.gene.nagoya_u.ac.jp)以及 PLACE (http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/ signalscan.html)等。啟動子克隆的方法也很多，其中PCR是很常用的手段，如環狀PCR包 括 I-PCRQnverse PCR)、P-PCR(panhandle PCR)，TAIL-PCR 和反向 PCR 等。目前，許多植物 啟動子已被克隆，并已申請了專利保護。但在水稻花粉特異啟動子方面，所見報道不多。
[0005] 水稻是我國的民族產業，研宄水稻開花機理意義重大。水稻的花粉形成發生在雄 蕊中的花藥中，花藥含有生殖細胞，這些生殖細胞形成絨氈層和花粉母細胞。絨氈層為雄配 子體的發育提供營養，包括各種酶類和非酶類蛋白質，并參與花粉外壁的合成。花粉母細胞 則進行減數分裂，產生四分體。四分體中的單細胞經絨氈層分泌胼胝酶的作用分離產生單 倍體小孢子體。單倍體小孢子體進一步發育，到晚期時形成中央大液泡。中央大液泡將細 胞核排擠到細胞邊緣（稱為單核靠邊期），形成細胞極性。這種細胞極性的促進小孢子體進 行一次不等有絲分裂，產生一個大的營養核和一個小的生殖細胞。小的生殖細胞被完全包 含在大的營養細胞內，形成細胞中細胞的特異現象。生殖細胞將進行第二次有絲分裂，產生 兩個精細胞，形成成熟的花粉粒。我們利用公共DND序列和基因表達數據，找到了水稻花器 特異表達基因，并通過DNA序列分析，得到了啟動子區域，其中一些基因經過RT-PCR和轉基 因驗證后，確定為水稻花粉特異啟動子。這些啟動子為水稻的基因工程，特別是在控制育性 和轉基因漂移等方面提供了新的選擇。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種植物花粉特異性啟動子及其應用。
[0007] 本發明提供的一種植物花粉特異性啟動子PCHF32,其為具有：
[0008] 1)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，
[0009] 或2)在SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸 且具有同等花粉特異性啟動功能的由1)衍生的核苷酸序列。
[0010] 其中，2)所述的由1)衍生的核苷酸序列，與1)所述的核苷酸序列為與1)相比具 有70%以上同源性，且具有同等花粉特異性啟動子功能的核苷酸序列。2)所述的由1)衍 生的核苷酸序列，例如SEQ ID NO: 1自第1500位至第2038位所示的核苷酸序列，已被驗證 具有與SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列同等的花粉特異性啟動子功能。
[0011] 本發明提供含有本發明所述植物花粉特異性啟動子PCHF32的重組表達載體。本 發明提供了含有上述重組表達載體的宿主細胞。
[0012] 本發明還提供與植物花粉特異性啟動子PCHF32核苷酸序列互補的DNA分子。本 領域技術人員根據相同目的能夠容易地鑒定并利用與植物花粉特異性啟動子PCHF32核苷 酸序列互補的DNA分子，因此，具有啟動子活性并在嚴格條件下與本發明啟動子序列或其 片段雜交的分離序列包括在本發明中。
[0013] 其中，所述核苷酸序列互補，是指在嚴格條件下能與PCHF32雜交。
[0014] 嚴格條件是指探針將與其靶序列雜交至可探測程度超過與其它序列雜交（如至 少2倍于背景）的條件。嚴格條件具有序列依賴性，且因環境的不同而不同。通過控制雜交 和/或洗滌條件的嚴格性，可以鑒定與探針100%互補的靶序列（同源探測）。可選擇地， 可以調節嚴格條件以允許一些序列錯配，使得探測到較低程度的相似性（異源探測）。通 常，探針長度短于大約1000個核苷酸，優選地短于500個核苷酸。
[0015] 典型地，嚴格條件是在pH值7