利用mTERT和mTyr雙啟動子聯合調控HN基因構建重組腺病毒的方法及重組腺病毒和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及構建重組腺病毒的方法，具體說，是一種利用mTERT和mTyr雙啟動子 聯合調控HN基因構建重組腺病毒的方法及重組腺病毒和應用。
【背景技術】
[0002] 黑色素瘤（melanoma)是一種常見的皮膚惡性腫瘤，其發病率較低，占惡性腫瘤的 1%~3%，但其惡性度高，轉移早且發生廣泛，是臨床治療過程中頗為棘手的惡性腫瘤。惡 性黑色素瘤具有快速生長W及高死亡率的特點，黑色素瘤的轉移往往發生在腫瘤形成的初 期階段，且轉移性的黑色素瘤侵襲性非常高，傳統的治療方法對其無效或效果很差。由于W 上的種種原因，使得研究者們亟需一種新的研究策略來治療惡性黑色素瘤。
【發明內容】
[000引本發明所要解決的技術問題是，提供一種利用mTERT和mTyr雙啟動子聯合調控HN 基因構建重組腺病毒的方法及重組腺病毒和應用。將兩種啟動子對腫瘤細胞的祀向性、HN 基因的細胞調亡作用和腺病毒載體系統高效穩定表達外源基因的特性結合起來，構建出能 夠融合表達上述基因的重組腺病毒，檢驗HN基因在雙啟動子的聯合調控作用下對B16細胞 的抑瘤作用。為進一步利用重組腺病毒在體內外誘導腫瘤細胞調亡及研制動物腫瘤的廣譜 疫苗奠定理論和實驗基礎。
[0004] 為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種利用mTERT啟動子和 mTyr啟動子調控HN基因構建重組腺病毒的方法，包括W下步驟： 陽0化]1)從巧7BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16細胞總RNA和新城疫病毒（NDV) LaSota株感染的雞胚尿囊液中分別擴增出mTERT啟動子基因序列GI:AF157502. UmTyr啟 動子基因序列GI:D00439. 1和HN基因序列GI:EF 211815. 1 ;
[0006] 所述的mTERT啟動子基因、mTyr啟動子基因和HN基因的擴增包括：W mTERTp-F SEQ ID NO :1和mTERTp-R沈Q ID NO :2為引物，W C57化/6小鼠的胸腺DM為模版，擴增 mTERT啟動子；WTy巧-F沈Q ID N0:3和Ty巧-R沈Q ID N0:4為引物，W小鼠黑色素瘤 B16細胞總RNA為模版，擴增mTyr啟動子；W HN-F沈Q ID NO :5和HN-R沈Q ID NO :6為 引物，W新城疫病毒NDV LaSota株感染的雞胚尿囊液為模版，擴增HN基因；
[0007] 2)將獲得的目的基因克隆到pShuttle-IRES-虹GFP-2穿梭載體中，線性化重組穿 梭載體后與骨架載體pAdeasy-1共轉染大腸桿菌BJ5183感受態細胞，使其在BJ5183內進 行同源重組，構建了包含目的基因的重組腺病毒質粒pAd-mTERTp-Ty巧-HN ;
[0008] 3)將重組腺病毒質粒由化C I酶切后，經脂質體介導轉染肥K293細胞，包裝獲得 重組腺病毒Ad-mTERTp-Ty巧-HN。
[0009] 所述的利用mTERT和mTyr雙啟動子聯合調控HN基因構建重組腺病毒的方法制備 的重組腺病毒。
[0010] 所述的利用mTERT和mTyr雙啟動子聯合調控HN基因構建重組腺病毒的方法制備 的重組腺病毒在防治小鼠黑色素瘤生物制品方面的應用。
[0011] 本發明的有益效果是：將mTERT啟動子對腫瘤細胞的祀向性、mTyr啟動子對小 鼠黑色素瘤的組織特異性、HN基因的細胞調亡作用與腺病毒表達載體系統高效穩定表達 外源基因的特性相結合，構建表達上述基因的重組腺病毒Ad-mTERTp-Ty巧-HN，使HN基因 在雙啟動的聯合調控作用下更好的發揮其在抑制腫瘤細胞生長及調亡方面的作用。通過 對重組腺病毒在B16細胞中外源基因的蛋白表達、細胞活力和細胞調亡的檢測，綜合評價 了重組腺病毒對B16細胞的抑瘤作用，研究結果顯示重組腺病毒Ad-mTERTp-Ty巧-HN對 B16細胞生長的抑制作用在第4d達到最大值，對B16細胞的調亡率為58. 39 + 1. 47%，其 余重組腺病毒均可在不同程度上抑制B16細胞的生長并誘導腫瘤細胞調亡，且重組腺病 毒Ad-mTERTp-Ty巧-HN的抑瘤作用（調亡率為58. 39 + 1. 47% )顯著優于對照組腺病毒 Ad-GFP(調亡率為19. 05 + 0. 89% ) (P<0. 05)。本發明最終研制出一種針對動物腫瘤性疾病 的廣譜疫苗。
【附圖說明】
[0012] 圖1是mTERTp、mTy巧和HN基因RT-PCR/PCR擴增結果（M:DL250bp DNA分子質量 標準；l:mTERTp基因PCR產物；2:mTy巧基因RT-PCR產物；3:HN基因PCR產物）。 陽01引 圖2是腺病毒穿梭載體的PCR擴增結果（M :DL 250bp DNA Marker ;1 :mTERT啟 動子片段的PCR擴增產物；2 :mTyr啟動子片段的PCR擴增產物；3 :HN基因的PCR擴增產 物；4 :mTERTp-HN基因片段的PCR擴增產物；5 :mTy巧-HN基因片段的PCR擴增產物；6 : mTERTp-mTy巧-HN基因片段的PCR擴增產物）。
[0014] 圖3是腺病毒穿梭載體雙酶切鑒定結果（M :DL化b DNA Marker ;1 :pShuttle-HN 經化e I和化o I的雙酶切產物；2 :p化uttle-mTERTp-HN經Bgl II和化o I的雙酶切產 物；3 :pauittle-mTy巧-HN 經 Sea I 和化〇 I 的雙酶切產物；4 :pauittle-mTERTp-Ty巧-HN 經Bgl II和化0 I的雙酶切產物）。
[0015] 圖4是重組腺病毒質粒的電泳結果（M:DL化b DNA Marker ;1:重組腺病毒質粒 pAd-HN ;2 :重組腺病毒質粒pAd-mTERTp-HN ;3 :重組腺病毒質粒pAd-mTy巧-HN ;4 :重組腺 病毒質粒pAd-mTERTp-Ty巧-HN ;5 :重組腺病毒質粒pAd-GFP)。
[0016] 圖5是重組腺病毒質粒的化CI酶切鑒定結果（M :DL化b DNA Marker ;1:重 組腺病毒質粒pAd-HN的化C I酶切產物；2 :重組腺病毒質粒pAd-mTERTp-HN的化C I 酶切產物；3 :重組腺病毒質粒pAd-mTy巧-HN的化C I酶切產物；4 :重組腺病毒質粒 pAd-mTERTp-Ty巧-HN的化C I酶切產物；5 :重組腺病毒質粒pAd-GFP的化C I酶切產物）。 陽017]圖6是重組腺病毒感染肥K293細胞巧光檢測圖（10X) (A:正常肥K293 細胞圖巧：重組腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染肥K293細胞后24h圖；C :重組 腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染肥K293細胞感染后24h巧光圖；D :重組腺病毒 Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染肥K293細胞感染后72h圖；E :重組腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN 感染肥K293細胞感染后7化巧光圖）。
[0018] 圖7是是重組腺病毒感染肥K293細胞后經RT-PCR檢測HN基因的結果（M:DL 250bp DM Marker ;1 :重組腺病毒Ad-HN ;2 :重組腺病毒Ad-mTERTp-HN ;3 :重組腺病毒 Ad-mTy巧-HN ;4 :重組腺病毒 Ad-mTERTp-Ty巧-HN)。
[0019] 圖8是重組腺病毒對B16的細胞毒作用（20 X) (A :正常B16細胞圖巧：重組腺病 毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染B16細胞后2地圖；C :重組腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染 B16細胞感染后2地巧光圖；D :重組腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染B16細胞感染后48h 圖；E :重組腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染B16細胞感染后4化巧光圖；F :重組腺病毒 Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染B16細胞感染后72h圖；G :重組腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感 染B16細胞感染后72h巧光圖）。
[0020] 圖9是Western blotting檢測重組腺病毒感染B16細胞后HN蛋白的表達情況。
[0021] 圖10是重組腺病毒對B16細胞的細胞活力影響研究。
[0022] 圖11是重組腺病毒誘導B16細胞調亡作用研究（A.重組腺病毒Ad-GFP ;B.重組 腺病毒Ad-HN ;C.重組腺病毒Ad-mTERTp-HN ;D.重組腺病毒Ad-mTy巧-HN化重組腺病毒 Ad-mTERTp-Ty巧-HN引起的B16細胞調亡率）（見表5)。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明：
[0024] 隨著分子生物學、免疫學、病理學及相關學科的發展，基因治療現已成為腫瘤學研 究的熱點。目前，腺病毒（adenovirus, Ad)載體療法是基因治療中最有前景的基因轉移方 法之一，它能有效的將外源基