一種豬肺特異性啟動子及其應用的制作方法

一種豬肺特異性啟動子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種動物肺特異性啟動子及其應用。本發明所提供的啟動子，是下述a）或b）或c)的DNA片段：a）3′端至少含有序列表中序列1的第1001-3000位核苷酸序列，并且從序列1的第1001位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5′端延長，得到長度為2000bp至3000bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能；b）與a）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段；c）在嚴格條件下與a）或b）限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。本發明所提供的啟動子在肺來源的細胞中特異表達目的基因，這對于培育抗呼吸系統傳染病的轉基因動物具有重要意義。
【專利說明】一種豬肺特異性啟動子及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種豬肺特異性啟動子及其應用，特別涉及一種來源于豬的肺泡表面活性蛋白B特異性啟動子及其應用。
【背景技術】
[0002]長期以來我國的豬群存欄與產量一直處于世界領先地位。隨著養殖業規模的擴大化、集約化，動物飼養密度不斷增加，動物疫病感染狀況日益復雜，動物疫病的發生和流行嚴重制約著我國養殖業的進一步發展和壯大。當前豬場傳染病發生日益嚴重，且發病面廣、傳染快、流行蔓延迅速、死亡率極高。據資料統計，自20世紀70年代以來新增加豬傳染病有21種，其中90年代以來新增加7種。豬的多種傳染病的發生和流行，嚴重打擊了農民養豬的積極性，阻礙了養豬業的發展。通過呼吸系統傳播的疾病占絕大多數，包括豬氣喘病、豬副嗜血桿菌病、豬鏈球菌病，豬肺疫、豬傳染性胸膜肺炎、豬傳染性萎縮性鼻炎、豬沙門氏菌病、豬流感、豬繁殖與呼吸綜合癥、豬圓環病毒病、豬附紅細胞體病、弓形蟲病等。如果能夠通過抗病育種的方法，培育抗呼吸系統傳染病的轉基因豬，減少呼吸系統傳染病的發生，將對我國的養豬業帶來巨大的經濟效益。
[0003]轉基因技術的關鍵在于使外源目的基因在轉基因動物體內穩定聞效的表達，而轉基因表達所用的啟動子起著非常重要的作用。啟動子是一段能使基因進行轉錄的DNA序列，轉錄的RNA通過進一步的翻譯和修飾形成功能蛋白質。根據啟動子作用的方式及功能不同，可以大致分為4類:組成型啟動子、誘導型啟動子、組織或發育階段特異型啟動子和合成型啟動子。外源基因在組織或發育階段特異型啟動子的調控下，能夠在某些特定的組織器官中表達。如果采用呼吸道特異表達的啟動子，利用轉基因技術將抗病基因在豬呼吸道特異表達，培育出能夠抗呼吸系統傳播疾病的轉基因豬，將在豬的遺傳改良中具有重大意義。目前已有一些組織特異性啟動子被應用于植物的遺傳改良中，獲得了顯著的成效。然而豬組織特異性啟動子的研究卻相對滯后，目前報道的豬組織特異性啟動子寥寥無幾。
[0004]肺表面活性物質(pulmonary surfactant, PS)是由肺泡II型細胞合成并分泌的一種脂蛋白復合物，具有降低肺泡表面張力、提高肺的順應性、促進肺氣體交換、參與肺的防御的生理功能。其主要成分是90%磷脂和8%~10%的肺表面活性蛋白(surfactantprotein, SP)。SP按其發現的先后順序，有SP-A，SP-B, SP-C和SP-D共4種，其中SP-A和SP-D是親水性蛋白，主要調節肺免疫功能，參與主動防御過程；SP-B和SP-C是疏水性蛋白，在維持正常肺呼吸功能上起重要作用。SP-B是一種極其重要的疏水蛋白，其表達明顯受肺泡II型上皮細胞和Clara細胞調控。它能增強吸附作用，促進磷脂分布，維持磷脂單層的穩定。除了作為肺泡表面活性物質的重要組成成分，SP-B還在天然免疫反應中起重要作用，可能使其出現過度炎癥反應。肺表面活性物質蛋白B在胎肺發育16周時開始表達，定位于上皮細胞胞漿，早期表達于高柱狀未分化上皮細胞，隨著支氣管發育，逐漸由呼吸道近端向遠端遷移，到原始肺泡期穩定表達于肺泡2型上皮細胞極其前體細胞，然后表達趨于穩定，生后肺內表達有明顯增加。
【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種動物肺特異性啟動子及其應用。
[0006]本發明所提供的動物特異性啟動子來源于豬(Sus scrofa domastica L.),是下述a)或b)或c)的DNA片段:
[0007]a) 3'端至少含有序列表中序列I的第1001-3000位核苷酸序列，并且從序列I的第1001位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為2000bp至3000bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能；
[0008]b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段；
[0009]c)在嚴格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。
[0010]所述嚴格條件是在2XSSC，0.1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次5min.0.5X SSC, 0.1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次15min。
[0011]所述啟動子的最后一位核苷酸是序列I的第3000位。
[0012]在本發明的一個實施例中，所述啟動子具體為下述al)_a3)中任一種:
[0013]al)核苷酸序列為 序列表中序列I的第1001-3000位核苷酸所示的DNA分子(SP-B2000)；
[0014]a2)核苷酸序列為序列表中序列I的第501-3000位核苷酸所示DNA分子(SP-B2500)；
[0015]a3)核苷酸序列為序列表中序列I所示DNA分子(SP-B3000)
[0016]序列表中序列I由3000個核苷酸組成，即為SP-B3000全長啟動子。而上述al)和a2)所述的啟動子為所述SP-B3000全長啟動子的5,端截短啟動子。
[0017]含有所述啟動子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍。
[0018]所述重組載體中，由所述啟動子啟動目的基因的表達。在本發明的一個實施例中，所述重組載體具體為在pGL3-Basic載體的多克隆位點插入所述啟動子得到的重組質粒。所述多克隆位點具體為限制性內切酶識別位點Kpn I和Hind III。所述目的基因具體為熒光素酶基因(luc)。
[0019]所述表達盒由所述啟動子，由所述啟動子啟動表達的目的基因，以及轉錄終止序列組成；所述啟動子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉錄終止序列連接。在本發明的一個實施例中，所述目的基因具體為熒光素酶基因(luc)。
[0020]所述啟動子在啟動目的基因在動物細胞表達中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0021]在所述應用中，所述動物細胞可為呼吸道細胞.[0022]進一步，所述呼吸道細胞可為肺來源的細胞。
[0023]在本發明的一個實施例中，所述動物細胞具體為A549細胞(人肺腺癌細胞)、LTEP-a-2細胞(人肺腺癌細胞)。
[0024]在所述應用中，所述表達具體為肺特異性表達。
[0025]所述肺特異性表達為在肺中的表達量顯著高于肺以外的其他部位。[0026]所述啟動子在制備用于培育抗呼吸系統傳染病的轉基因動物的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。所述動物可為豬等。
[0027]本發明利用相關生物信息學技術、分子生物學技術及轉基因技術，在豬的全基因組中找到了 SP-B的基因序列，從杜X長X大豬的基因組中克隆了豬SP-B的啟動子序列，將該啟動子序列連入pGL3-Basic載體中，將構建的質粒轉染真核細胞系，通過檢測啟動子所驅動的熒光素酶報告基因的活性確定了豬SP-B啟動子是肺特異性啟動子。
[0028]本發明所提供的豬肺特異性表達啟動子具有如下特點:
[0029]1、本發明啟動子序列來源于豬基因組，在多個真核細胞中驗證了其組織表達特異性，確定了其只在肺來源細胞中特異性表達外源基因。
[0030]2、啟動子SP-B2000已去掉了非功能區，只保留了核心啟動子區，可直接應用到豬轉基因工程和分子育種。
[0031]本發明對培育抗 呼吸系統傳染病的轉基因動物具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為豬SP-B3000啟動子的PCR擴增產物的瓊脂糖電泳圖。其中，泳道M為DNA分子量標準(NP5000);泳道I為PCR產物。
[0033]圖2為重組表達載體pGL3-SP-B3000和pGL3-SP_B2000的酶切鑒定電泳圖。其中，泳道M為DNA size DNA分子量標準(NP5000);泳道I為Kpn I/Hind III雙酶切PGL3-SP-B3000 產物；泳道 2 為 Kpn I/Hind III 雙酶切 pGL3-SP_B2000 產物。
[0034]圖3為驗證豬SP-B3000啟動子區不同截短體的啟動子活性(不同載體的突光素酶相對活性的測定結果)。直方圖表示熒光素酶相對活性，誤差線用標準差標示，重復數為4。其中，basic 表不 pGL3-Basic 載體；control 表不 pGL3_control 載體；_500 至-3000 依次表示 pGL3-SP-B500 至 pGL3-SP_B3000 —系列 pGL3_SP_B 載體。
[0035]圖4為驗證豬SP-B2000啟動子在不同來源的細胞上的啟動子活性(不同細胞的熒光素酶相對活性的測定結果)。直方圖表示熒光素酶相對活性，誤差線用標準差標示，重復數為 4。其中，SP-B2000 即表示 pGL3-SP-B2000。
【具體實施方式】
[0036]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0037]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0038]弓丨物由北京博邁德生物科技有限公司合成，2XPfuPCR MasterMix (10212-01)，NP5000 核酸 Marker (20211-01)，pTP-BSl 克隆載體(30222-01)，定點突變試劑盒(80111-01)購自北京諾派生物科技有限公司，血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司(DP304-02)，質粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，pGL3-Control 載體(E1741)，pGL3_Basic 載體(E1751 )，PRL-TK 質粒(E2241 )，熒光素酶活性檢測試劑盒(E1910)購自美國Promega公司，lipofectamine2000購自美國invitrogen 公司(11668-019)，DMEM 培養基購自美國 GIBICO 公司(12100-046)，1640 培養基購自美國GIBICO公司(31800-022)，A549細胞(人肺腺癌細胞)、LTEP-a-2細胞(人肺腺癌細胞)、Hela細胞(人宮頸癌細胞)、Caco-2細胞(人結腸癌細胞)、293T細胞(人胚腎細胞)、HepG2細胞(人肝癌細胞)和CNE2細胞(人鼻咽癌細胞)均購自上海細胞庫。杜X長X大豬購自北京市大興區種豬場。
[0039]實施例1、豬SP-B3000啟動子的克隆及序列測定
[0040]一、引物設計
[0041]從GENBANK上檢索到豬的SP-B基因序列(GENBANK:AM779476.1 )，通過BLAST軟件對豬全基因組進行同源性分析，尋找到豬基因組中的SP-B基因序列位置，選取豬SP-B基因上游5’側翼3000bp設計引物。設計的引物序列如下，引物引入Kpn I和Hind III限制性酶切位點，人工合成:
[0042]Fl (引物 1):5’ -CGGGGTACCATCTGATGTTGCTATGGCTGT-3’ (下劃線處為 Kpn I 的識別序列，其后的序列為序列I的第1-21位)
[0043]Rl (引物 2):5’ -CCCAAGCTTCCGCAGCCTGGACACCCT-3’ (下劃線處為 Hind III 的識別序列，該序列的第9-27為序列I的第2982-3000位的反向互補序列)
[0044]二、豬全基因組的提取
[0045]取新鮮健康的杜X長X大豬的肝臟組織約200mg，迅速剪碎后轉移到玻璃研磨器中，采用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取組織全基因組DNA，具體操作參照試劑盒說明書。
[0046]三、PCR擴增豬SP-B3000啟動子區
[0047]以步驟二提取的豬基因組DNA為模板，在引物Fl和引物Rl的引導下，利用2XPfu PCR MasterMix并參照試劑盒說明書進行擴增，反應條件為:首先94°C 5min ;其次94°C 30sec,60°C 30sec, 72°C 3min,共 35 個循環；最后 72°C 5min。將 PCR 產物進行瓊脂糖電泳檢測。
[0048]四、測序及序列分析
[0049]將PCR擴增的大小約3000bp左右的目的DNA亞克隆入平端載體pTP_BSl中，經篩選后挑取單克隆測序，將經測序后表明含有序列表中序列I所示DNA片段(SP-B3000)的重組質粒命名為PTP-SP-B3000。序列I由3000個核苷酸組成。
[0050]實施例2、豬SP-B3000啟動子功能鑒定
[0051]一、重組表達載體的構建
[0052]將實施例1中獲得的重組質粒PTP-SP-B3000用限制性內切酶Kpn I和Hind III雙酶切后，與經同樣雙酶切的pGL3_Basic載體的骨架片段相連，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，獲得陽性重組菌，將經PCR檢測(圖1)和酶切鑒定(圖2中泳道I)含有大小約為3000bp目的條帶的的重組載體送樣測序，將測序表明含有SP-B3000啟動子(序列I)的重組載體命名為PGL3-SP-B3000，將含有該重組載體的重組菌命名為DH5 a -pGL3-SP_B3000。
[0053]利用定點突變試劑盒，對已構建的PGL3-SP-B3000質粒進行截短突變，具體操作參照說明書。依次從SP-B3000的5 ’端進行截短，突變成pGL3-SP-B2500(在pGL3_Basic載體的 Kpn I 和 Hind III 之間插入序列 I 的第 501-3000 位)、pGL3-SP_B2000(在 pGL3_Basic 載體的 Kpn I 和 Hind III 之間插入序列 I 的第 1001-3000 位)、pGL3-SP_B1500(在pGL3_Basic載體的Kpn I和Hind III之間插入序列I的第1501-3000位)、pGL3-SP-B1000 (在pGL3-Basic 載體的 Kpn I 和 Hind III 之間插入序列 I 的第 2001-3000 位)、pGL3-SP_B500(在pGL3-Basic載體的Kpn I和Hind III之間插入序列I的第2501-3000位)，共5個截短質粒。對5個截短質粒均進行Kpn I和Hind III雙酶切鑒定及測序鑒定，證實其準確性。其中pGL3-SP-B2000經Kpn I和Hind III雙酶切的鑒定結果如圖2 (泳道2)所示。將含有這5個截短質粒的重組菌，依次命名為DH5 a -pGL3-SP-B2500、DH5 a -pGL3-SP_B2000、DH5 a -pGL3-SP-B1500、DH5 α -pGL3-SP_B1000、DH5 α -pGL3-SP_B500。將上述所構建的 5 個截短質粒中攜帶的外源DNA片段按照外源DNA片段由小到大的順序依次命名為:SP-B500、SP-B1000、SP-B1500,SP-B2000、SP-B2500。
[0054]二、質粒提取與鑒定
[0055]將上述重組菌DH5 a-pGL3-SP_B3000、DH5 a-pGL3-SP_B2500、DH5 a-pGL3-SP-B2000、DH5a-pGL3-SP-B1500、DH5 a -pGL3-SP-B I OO O、DH5 a -pGL3-SP-B500分別接種于含氨芐青霉素的LB培養基中，在37°C條件下，200轉/分(旋轉半徑為13mm)搖床上振蕩培養至0D_值為1，采用質粒小提試劑盒抽提重組菌的質粒，即步驟一構建的6個重組表達載體，具體操作參照試劑盒說明書。
[0056]三、細胞培養
[0057]將A549細胞、Hela細胞、Caco-2細胞，HepG2細胞、293T細胞、LTEP-a-2細胞和CNE2 細胞在 10% (v/v)新生牛血清的含雙抗 DMEM (Dulbecco，s Modified Eagle’sMedium)培養基中，其培養條件為37°C，濃度為5%的C02。當細胞完全鋪板時，進行傳代培養，操作如下:用洗滌液快速洗滌細胞一次，加入2mL胰酶，37°C消化約為2分鐘，在顯微鏡下觀察到細胞已成球狀后立即棄去胰酶，向培養基中加入細胞生長培養基，并用吸管吹打細胞使盡量以單個細胞的形式存在。將獲得的細胞懸液一部分留在細胞培養瓶中傳代培養，另一部分等體積分裝到24孔板中，置于培養箱中培養用于轉染。
[0058]四、轉染
`[0059]當24孔板中細胞達到60%_70%的匯合率時準備轉染。首先吸去培養液，加入無血清無雙抗的optiMEM換液培養。其次將步驟一構建的6個重組表達載體、作為陰性對照的pGL3-Basic載體(沒有啟動子啟動熒光素酶基因的表達)、作為陽性對照的pGL3-Control載體(SV40啟動子啟動熒光素酶基因的表達)分別用optiMEM稀釋成IOOng/μ 1，將作為內參照的載體PRL-TK (Τ7啟動子啟動熒光素酶基因的表達)稀釋成50ng/l.! 1，按Iyg質粒需0.75μ I的lipofectamine2000計算所需的轉染試劑的量。按說明書要求用optiMEM稀釋lipofectamine2000，輕輕混勻，室溫下靜置5分鐘后將轉染試劑和質粒混合均勻，再室溫靜置20分鐘。取轉染液100 μ I滴加到24孔板的其中一個孔中，這樣每個重組表達載體可保證4次重復。轉染過程需在換液后2h內完成。轉染完成后放入培養箱中溫育，6小時后棄凈24孔板里液體，PBS清洗一次后加入10% (v/v)新生牛血的無雙抗DMEM培養基繼續培養，24-48小時后收集細胞。
[0060]五、熒光素酶相對活性測定與分析
[0061]使用熒光素酶活性檢測試劑盒對步驟四轉染后的細胞進行活性測定，測定前，準備以下試劑:(I) IX磷酸裂解緩沖液(PLB)，用購自美國Promega公司試劑盒提供的5XPLB與滅菌水按體積比1:4比例混合，每次使用前配置；(2) LARII (Luciferase AssayReangentII突光分析劑)，將美國Promega公司試劑合提供的凍干突光分析底物重懸于IOml的LARII中，混勻，分裝后做上標記置于_70°C保存備用；(3)Stop Glo Reagent，每次使用前配置，將50 X Stop & Glo Substrate (終止劑)與Stop Glo Buffer (終止緩沖劑)按體積比1:50混合，試劑配置完畢后進行熒光素酶活性測定，操作步驟如下:
[0062]I)將上述24孔板中轉染有目的DNA的貼壁細胞用I XPBS洗滌一次，棄去殘液，加Λ 100 μ I新鮮配制的1XPLB，室溫下，置于冰上15分鐘，然后_80°C凍融一次；
[0063]2)用移液器吹吸兩次后將裂解液收集到1.5ml離心管做好標記，待用；
[0064]3)取若干個1.5ml離心管，均加入50 μ I的LLARII溶液(_70°C取出，室溫下融化)，備用;
[0065]打開Luminometer20/20照度計(購自美國Promega公司)電源開關,進入“HOME”主菜單，按下“Protocol”設定工作模式中各種參數,包括:Display顯示,3S ；integrate time(整合時間)IOS ；repeat (重復)；靈敏度選用默認值；設定好后返回“HOME” ；
[0066]4)在“HOME”狀態下，在含50 μ I LARII溶液的1.5mL離心管中加入上述步驟
2)制備好的樣品?ομ 1，用吸頭混合后，放入樣品檢測池中，按“Measure”，儀器自動處理，計算出螢火蟲熒光酶素(6個重組表達載體、陰性對照pGL3-Basic載體以及陽性對照pGL3-Control載體中的突光素酶基因所表達)活力，顯示加入Stop & Glo Substrate頁面，此時取出1.5mL離心管，再加入50 μ I新鮮配置的Stop Glo Reagent，混勻后，放回樣品檢測池中，按“0K”儀器便會現計算出海腎熒光素酶活力(內參照載體PRL-TK中的熒光素酶基因所表達)，并計算出兩種熒光素酶活力比值，即熒光素酶相對活力，記錄結果，然后，繪制直方圖。
[0067]對不同載體熒光素酶活性的檢測結果如圖3 (A549細胞)所示，所構建的PGL3-SP-B系列質粒(步驟一構建的6個重組表達載體)的熒光素酶活性與陰性對照(pGL3-Basic載體)相比均達 到顯著差異(P < 0.05)，表明重組表達載體中各自在多克隆位點Kpn I和Hind III之間的外源DNA片段均具有啟動子活性；與陽性對照(pGL3-Control載體)相比，PGL3-SP-B 系列質粒中的 pGL3-SP-B3000、pGL3-SP-B2500、pGL3-SP-B2000 這 3個重組表達載體的熒光素酶活性高很多或者至少齊平，表明這3個重組表達載體中所插入的外源DNA片段的啟動子活性很高。其中，以重組表達載體PGL3-SP-B2000的熒光素酶活性最高，PGL3-SP-B2500次之。綜上所述，SP-B啟動子的核心區在SP-B2000 (序列I的第1001-3000 位)區域。
[0068]對不同組織來源的7種細胞檢測pGL3-SP-B2000的啟動子活性，證明了其只在肺(A549細胞和LTEP-a-2細胞)具有較強的啟動子活性，證明了該啟動子是肺特異性啟動子，結果如圖4所示。
【權利要求】
1.DNA分子，是下述a)或b)或C)的DNA片段: a)3'端至少含有序列表中序列I的第1001-3000位核苷酸序列，并且從序列I的第1001位開始、按照序列I的核苷酸序列向序列I的5'端延長，得到長度為2000bp至3000bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能； b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段； c)在嚴格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。
2.根據權利要求1所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子的最后一位核苷酸是序列I的第3000位。
3.根據權利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子為下述al)-a3)中任一種: al)核苷酸序列為序列表中序列I的第1001-3000位核苷酸所示的DNA分子； a2)核苷酸序列為序列表中序列I的第501-3000位核苷酸所示DNA分子； a3)核苷酸序列為序列表中序列I所示DNA分子。
4.含有權利要求1-3中任一所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體中，由權利要求1-3中任一所述DNA分子啟動目的基因的表達。
6.權利要求1-3中任一所述DNA分子在制備啟動目的基因在動物細胞表達的產品中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于:所述動物細胞為呼吸道細胞。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述呼吸道細胞為肺來源的細胞。
9.根據權利要求6-8中任一所述的應用，其特征在于:所述表達為肺特異性表達。
10.權利要求1-3中任一所述的DNA分子在制備用于培育抗呼吸系統傳染病的轉基因動物的產品中的應用。
【文檔編號】C12N5/10GK103525817SQ201310447351
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月25日 優先權日:2013年9月25日
【發明者】劉文軍, 楊利敏, 李晶, 畢玉海, 賈曉娟, 曹帥 申請人:中國科學院微生物研究所