耐高溫異淀粉酶基因的克隆、表達及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程和生物能源技術領域，具體涉及一種耐高溫異淀粉酶基因克隆、表達及在酶生物燃料電池中的應用。
【背景技術】
[0002]生物燃料電池是以有機物為原料，利用細胞或酶將化學能轉化為電能的一類綠色燃料電池。根據催化劑種類可分:微生物燃料電池和酶生物燃料電池，它們具有能量轉化效率高、生物相容性好、原料來源廣泛、成本低廉且環保等優點，在醫療、電子、環境保護等領域均有重要的使用價值。但目前大部分的生物燃料電池輸出功率密度較低，極大限制了在生產中的應用。微生物燃料電池由于對電子屏蔽作用明顯和較多副反應導致對燃料使用效率較低，而酶生物燃料由于催化劑濃度較高并且沒有傳質壁皇，因此有可能產生更高的輸出功率，在室溫和中性溶液中工作，滿足一些微型電子設備或生物傳感器的需求。另外，與甲醇燃料電池相比，糖分(淀粉或葡萄糖)驅動的酶燃料電池因原料成本低廉，生物可降解性更強，更綠色環保而獲得研宄者青睞。最新研宄表明:在不消耗ATP前提下，通過人工合成的多酶催化途徑，可以實現淀粉水解為葡萄糖和葡萄糖徹底氧化偶聯技術，這有力推動了高能量密度的酶燃料電池的發展，為淀粉類原料在酶燃料電池中的應用提供了很大可能性。但針對淀粉類原料中的支鏈淀粉和麥芽糖糊精，由于存在大量糖苷鍵分支位點(如圖1所示)，在α-葡聚糖磷酸化酶作用下，水解為葡萄糖-1-磷酸效率偏低，造成能源浪費和酶燃料電池能量密度的降低。針對支鏈淀粉和麥芽糖糊精，異淀粉酶或普魯蘭酶可以將支鏈淀粉和麥芽糖糊精中的α -1，6糖苷鍵水解，切下整個側枝，形成直鏈淀粉，極大提高了α -葡聚糖磷酸化酶水解支鏈淀粉的能力。但是，目前已發現的普魯蘭酶或異淀粉酶都存在穩定性差，不耐熱等問題，限制了此類酶在工業中的應用。所以，耐高溫異淀粉酶的發現和應用對提高新型淀粉燃料電池作用至關重要。
【發明內容】
[0003]本發明主要目的是提供一種耐高溫異淀粉酶基因序列，同時提供該序列所表達蛋白的制備方法及該蛋白在酶生物燃料電池中的應用。
[0004]本發明所采取的技術方案如下。
[0005]一種耐高溫異淀粉酶基因，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示，全長2151bp，該基因從 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數據庫中的tokodaii基因組中篩選獲得，其代碼為:0RF ST0928。
[0006]所述耐高溫異淀粉酶基因所編碼耐高溫異淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，包括716個氨基酸，分子量為83.lKDa，其中編碼序列17~108氨基酸為第48家族的碳水化合物結合模序(CBM);編碼序列204~545氨基酸為淀粉酶催化結構域；編碼序列546-716為未知功能多肽；該酶在本發明申請之前被推定為一種糖原脫枝酶，本申請則經過驗證證明其為耐高溫異淀粉酶。
[0007]所述耐高溫異淀粉酶的制備方法，包括以下步驟:
(1)基因克隆，通過設計引物，應用PCR技術擴增或人工合成方法得到包含異淀粉酶基因全長序列；
設計引物序列設計如下:
IF:5’ ACTTT AAGAA GGAGA TATAC ATatg gtttt ttcac acaag gatag accat 3’，
IR:5’ TCAGT GGTGG TGGTG GTGGT Gatat tcaat cctcc tatat accat tgcgg 3’ ；
VF:5’ ccgca atggt atata ggagg attga atatC ACCAC CACCA CCACC ACTGA 3、
VR:5，atggt ctatc cttgt gtgaa aaaac catAT GTATA TCTCC TTCTT AAAGT 3，0
[0008]其中其中IF和IR的5’端大寫堿基屬于pET20b (+)載體上的序列，3’端小寫堿基屬于插入基因ORF ST0928上序列；VF和VR的5’端小寫堿基屬于插入基因ORF ST0928上序列，3’端大寫堿基屬于pET20b (+)載體上序列，IF與VR反向互補，IR與VF反向互補；
(2)載體構建，分別以異淀粉酶基因和市售載體上的序列為模板，采用文獻You等(DNACloning and Assembly Methods, Humana Press，2014，183-192)提供的簡單克隆方法，進行重疊延伸PCR得到重組表達質粒；
(3)異淀粉酶表達與純化，將重組質粒轉入萬.coliRosetta (DE3)中，挑選陽性重組子培養，IPTG誘導表達，收獲細胞，超聲破碎后，使用鎳柱將帶有His標簽的異淀粉酶純化出來。
[0009]所述耐高溫異淀粉酶，最適反應條件為:以500 μ L反應體系為例，含40 mM乙酸緩沖液(pH 5.5)，添加有0.5 mM MgCl2,85°C催化反應。
[0010]所述耐高溫異淀粉酶可用于酶生物燃料電池中，所述酶生物燃料電池為單極室無隔膜類型，結構包括:反應容器、離子交換膜和反應物；
所述反應物包括:淀粉、耐高溫異淀粉酶、α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖變位酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、二氫硫辛酸脫氫酶、HEPES緩沖液、NaCl、NAD+、Mg2+、Mn2+和電子穿梭體(AQDS)；
具體為:淀粉、0.012%耐高溫異淀粉酶(質量體積比)、7U α -葡聚糖磷酸化酶(a GP)、3U磷酸葡萄糖變位酶(PGM)、1.5U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)、5.4 U 二氫硫辛酸脫氫酶(DI)、50 mM pH 7.2 的HEPES緩沖液、0.3 M NaCl,4 mM NAD+,5 mM Mg2+、0.25 mM Mn2+、1.7 mM電子穿梭體(AQDS)。
[0011]發明人從KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)數據庫中，對于最適生長溫度在80°C的耐高溫古生菌Sulfolobus的基因組進行篩選后發現，其開放閱讀框ORF ST0928序列，理論推測其具有糖原脫枝酶活性，但目前還沒有任何相關文獻對其生化性質進行過詳細描述。發明人采用基因工程方法，通過將ORF ST0928序列進一步轉化整合進入大腸桿菌進行誘導表達后，得到一種新的耐高溫異淀粉酶重組蛋白，檢測結果表明，該耐高溫異淀粉酶熱穩定性優良，在90°C條件下半衰期可達200min，用于糖燃料電池時，有望取得優良效果。具體而言，該耐高溫異淀粉酶的優勢在于:(I) ORF ST0928基因編碼的異淀粉酶耐高溫、酶活力穩定，具有很強工業應用潛力；(2)該耐高溫異淀粉酶用于糖燃料電池時，可使淀粉類物質徹底水解為葡萄糖，從而提高能量轉化效率，拓展生物燃料電池的應用范圍。
【附圖說明】
[0012]圖1為異淀粉酶作用原理圖；
圖2為表達載體pET20b-StIA構建圖；
圖3為目的蛋白即耐高溫異淀粉酶電泳檢測結果；
圖4為糖燃料電池構造原理圖，其中#1為異淀粉酶；#2為α -葡聚糖磷酸化酶;#3為磷酸葡萄糖變位酶；#4為6-磷酸葡萄糖脫氫酶；#5為二氫硫辛酸脫氫酶；AQDS為電子穿梭體；
圖5為糖燃料電池實物圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例對本發明做進一步的解釋說明。
[0014]實施例1
本發明所提供的耐高溫異淀粉酶基因，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示，全長2151bp，該基因從 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數據庫中的 SwJ/bJo/ws?ο左ο?/aii基因組中篩選獲得，其代碼為:0RF ST0928。
[0015]所述耐高溫異淀粉酶基因所編碼耐高溫異淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，包括716個氨基酸，分子量為83.lKDa，其中編碼序列17~108氨基酸為第48家族的碳水化合物結合模序(CBM);編碼序列204~545氨基酸為淀粉酶催化結構域；編碼序列546-716為未知功能多肽；該酶在本發明申請之前被推定為一種糖原脫枝酶，本申請則經過驗證證明其為耐高溫異淀粉酶。
[0016]所述耐高溫異淀粉酶的制備方法，包括以下步驟:
(I)基因克隆，通過設計引物，應用PCR技術擴增或人工合成方法得到包含異淀粉酶基因全長序列；具體步驟如下:
A.設計引物，以KEGG數據庫公布的11i/aii基因組中的序列片段ORFST0928和市售pET20b (+)載體為模板，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物如下:
IF:5’ ACTTT AAGAA GGAGA TATAC ATatg gtttt ttcac acaag gatag accat 3，，
IR:5’ TCAGT GGTGG TGGTG GTGGT Gatat tcaat cctcc tatat accat tgcgg 3’ ；
VF:5’ ccgca atggt atata ggagg attga atatC ACCAC CACCA CCACC ACTGA 3、
VR:5，atggt ctatc cttgt gtgaa aaaac catAT GTATA TCTCC TTCTT AAAGT 3，0
[0017]其中其中IF和IR的5’端大寫堿基屬于pET20b (+)載體上的序列，3’端小寫堿基屬于插入基因ORF ST0928上序列；VF和VR的5’端小寫堿基屬于插入基因ORF ST0928上序列，3’端大寫堿基屬于pET20b (+)載體上序列，IF與VR反向互補，IR與VF反向互補。
[0018]B.\>丄Sulfolobus 1Aot/aii基因組為模板，步驟A所設計IR、IF序列為引物進行PCR擴增，
反應體系為:高保真DNA聚合酶(按說明書用量，0.02U/yL) ;dNTP各200 μ Μ;引物各0.5 μ M ;模板 0.05ng/ μ L0
[0019]擴增條件為:98°C預變性30s，25個循環(98°C變性10 s，60°C退火10 s，72°C延伸)，最后一步72°C延伸10 min。
[0020]取3 μ L擴增產物使用0.8%的瓊脂糖凝膠純化，純化產物送華大基因進行測序。測序結果表明，PCR擴增產物所得基因序列與SEQ ID N0.1所示核苷酸序列相同，即ORFST0928 序列。
[0021]用PCR產物回收試劑盒回收PCR擴增產物，對回收產物用紫外分光光度計進行含量測定，備用。
[0022](2)載體構建，構建過程參考圖2所示，分別以異淀粉酶基因和市售pET20b (+)載體上的序列為模板，米用文獻You等(DNA Cloning and Assembly Methods,Humana Press，2014，183-192)提供的簡單克隆方法，進行重疊延伸PCR得到重組表達質粒；具體步驟如下:
C.以市售pET20b (+)載體為模板，步驟A所設計VR、VF序列為引物進行PCR擴增，
反應體系:高保真DNA聚合酶(按說明書用量，0.02U/μ L) ;dNTP各200 μΜ;引物各0.5“]?;模板0.05叩/^1^1\6〇 buffer ο
[0023]擴增條件為:98°C預變性30s，30個循環(98°C變性15 s，55°C退火15 s，72°C延伸 3kb/min)，最后一步 72°C延伸 5 min。
[0024]擴增產物純化、測序，得到如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即ORF ST0928序列，使用PCR產物回收試劑盒進行回收，最后使用紫外分光光度計進行含量測定，備用。
[0025]D.重疊延伸PCR得到重組表達質粒，
具體為，按照文獻You et al.2014提供的方法，將步驟(I)中PCR擴增回收得到的ORFST0928序列產物與步驟C中PCR擴增回收產物混合，進行重疊延伸PCR。
[0026]混合反應體系設置如下:5倍的GC緩沖液，10 μ L ；dNTP (各10 μ M)，I μ L ；DNA載體片段(步驟C所回收產物)，4 ng/yL (16 μ L);插入片段(步驟I所回收產物)，4 ng/μ L(5 μ L);水添加到49.5 μ L，高保真DNA聚合酶，0.5 μ L (1.0單位/50 μ L)。
[0027]反應條件為:98