一種利用高溫破壁制備重組酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用高溫破壁制備重組酶的方法，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著我國社會對環境保護要求的提高，以酶工程技術為核心的綠色化工工藝取得了較多的應用。諸如阿托伐他汀、辛伐他汀、孟魯司特、阿扎那韋等等醫藥化工產品的生產紛紛轉向生物催化劑進行催化合成來實現。
[0003]而生物催化劑的生產則通常采用基因工程技術，以大腸桿菌為宿主，通常借助于強啟動子T7，使宿主菌的資源充分用于外源蛋白(重組酶)的表達。發酵結束后，采用離心或膜過濾的方法收集大腸桿菌細胞，并使細胞破壁后釋放其中的酶蛋白(重組酶)得到所需的生物催化劑。
[0004]目前，對于大腸桿菌或重組大腸桿菌進行破壁的方法主要有:研磨法:通過在細菌懸液中加入研磨劑，研磨時研磨劑顆粒碰撞而破碎細胞，可用的研磨劑有氧化鋁、玻璃珠、玻璃粉等。超聲波法:利用超聲波對細胞內所產生的空穴作用破菌，同時超聲過程產生的漩渦對菌體也有剪切力，有助于破菌。壓力法:分為兩種:a.氣壓法，就是對樣品罐加壓，使菌體內壓力增加，然后泄壓，此時菌體內壓力高于外界，菌體自身漲破；b.高壓均質機的破菌過程，細胞懸液以極快的速度撞擊靜止面，使菌體破碎，這是目前工業生產中應用最多的方法。滲透法:將懸液與高滲透壓液體中平衡，再轉移至低滲透壓液體中，此時大量水分滲入細胞，使細胞破裂。凍融法:細胞內胞液凍結時產生冰晶，體積增大，撐破菌體。酶解法:分為菌體自溶和溶菌酶兩種方法，菌體自溶可以在大腸桿菌發酵時加入低濃度抗生素，干擾胞壁形成，有助于菌自溶，但加入非質粒抗性的抗生素往往干擾菌的生長，難以得到較好的結果。溶菌酶就是水解1，4_糖苷鍵，破壞胞壁中的肽聚糖，對陽性菌作用較大。對于陰性菌，因為存在脂多糖，必須加入Η)ΤΑ、去垢劑等以螯合連接相鄰脂多糖的Ca、Mg離子，從而破壞脂多糖。但是，由于種種限制，上述各種破壁方法中，僅氣壓法中的采用高壓均質機破壁法真正用于酶的工業化制備上。然而高壓均質機破壁法對設備依賴嚴重，高壓均質機價格高昂易損壞，對發酵原料要求也較高，同時還需要在發酵結束后先離心去掉發酵清液，再重新配制緩沖液將菌體重懸，均質破壁后還需要進一步離心或超濾去除菌體碎片，最終得到可以應用的生物催化劑。該過程對發酵原料要求高，對設備依賴嚴重，工序多，廢水多，對于酶的高效制備，工業上仍期待有突破性的方法。
【發明內容】
[0005]本發明針對以上現有技術中存在的缺陷，提出一種利用高溫破壁制備重組酶的方法，解決的問題是如何通過高溫處理對細胞壁進行破壁來提取相應重組酶的效果。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案得以實現的，一種利用高溫破壁制備重組酶的方法，該方法包括以下步驟:
[0007]A、將含有表達重組酶的重組大腸桿菌接種到經過滅菌處理的發酵培養基中進行活化培養，使菌體活化之后再加入誘導劑，然后，再控制溫度在25°C?37°C進行低溫發酵培養；
[0008]B、低溫發酵培養結束之后，將溫度升溫至39°C?60°C繼續進行高溫發酵培養，高溫發酵培養結束之后，直接從發酵液中提取相應的目標重組酶，得到相應的目標重組酶。
[0009]本發明利用高溫破壁制備重組酶的方法，通過在低溫條件下將菌體活化培養成活之后，再加入誘導劑，目的是為了更有效的使外源蛋白(即相應的重組酶)得到表達，使能夠充分利用大腸桿菌中的資源，保證重組酶的產量和效率，相比與現有一般的菌體培養過程基本是將溫度控制在37°C以下的條件下培養至結束，通過后續破壁來實現提取相應的外源蛋白(重組酶)，本發明是直接在培養過程中將溫度升溫繼續高溫培養，目的是使在細胞處于較年輕狀態時提高溫度來使細胞壁處于較脆弱的狀態下加速代謝，從而使在營養物質消耗到一定程度時利于細胞裂解，從而實現直接在培養過程中就能夠使細胞壁處于破壁狀態，達到破壁的效果。從而避免了收集菌體、采用均質機進行破壁的過程，具有工藝簡潔，廢水量少的優點，是一種更為綠色環保的工藝路線，具有重要的應用價值；同時，還能夠保證酶活的性能，實現既保證提高破壁的效果，降低生產成本，又能夠實現高酶活的性能。由于本發明的主要如何實現對大腸桿菌細胞壁的破壁效果，因此，對于大腸桿菌中的重組酶并沒有具體的限定要求，如所述的含有表達重組酶的重組大腸桿菌還可以是含有表達轉氨酶、羰基還原酶、水解酶、異構酶或裂解酶等的重組大腸桿菌，同樣能夠實現本發明的效果。上述所述活化培養采用本領域常規的溫度即可，一般控制溫度在37°C以下進行活化培養即可，優選，活化培養的溫度控制在25°C?37 °C。
[0010]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優選，還包括向發酵液中加入能夠與目標重組酶相互作用的載體進行固定化，得到固定化后的重組酶。由于本發明發酵結束之后就能夠實現破壁的效果，避免了菌體收集、破壁、酶提取純化等過程，直接離心收集的上清液即可用于相應的催化反應，具有工藝更簡潔的效果。
[0011]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優選，步驟A中所述含有表達重組酶的重組大腸桿菌選自含有表達羰基還原酶的重組大腸桿菌或含有表達轉氨酶的重組大腸桿菌。
[0012]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優選，所述含有表達重組酶的重組大腸桿菌選自含有表達His-tag標記的羰基還原酶的重組大腸桿菌或含有表達His-tag標記的轉氨酶的重組大腸桿菌。通過His-tag標記目的是為了有利于后續相應的酶與載體具有更好的連接效果，使實現更好的固定化作用。
[0013]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優選，步驟A中所述含有表達重組酶的重組大腸桿菌中還含有T7啟動子。T7啟動子能高效啟動下游外源蛋白的表達。
[0014]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優選，步驟A中所述誘導劑選自乳糖或異丙基巰基半乳糖苷。有利于發酵培養過程中相應的重組酶的表達，使充分利用大腸桿菌中的資源生成相應的重組酶，有利于提高收率效果。作為進一步的優選，所述異丙基巰基半乳糖苷的濃度為0.lmmol/L?10mmol/L或所述乳糖的濃度為5?50g/L。通過誘導劑在發酵液中的濃度優化更有利于重組酶的表達。
[0015]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優選，步驟A中所述低溫發酵培養的時間為0.5?8.0小時。通過控制加入誘導劑后的發酵時間，目的是為了控制細胞壁的生成狀態，使細胞處于較年輕的狀態(即生長不完全)進入高溫狀態培養，從而使細胞較脆弱，在高溫狀態時就能夠加速代謝，實現對細胞壁進行破壁的效果。作為進一步的優選，所述低溫發酵培養的時間為1.0?4.0小時。
[0016]在上述利用高溫破壁制備重組酶的方法中，作為優選，步驟B中所述能與目標重組酶相互作用的載體選自帶有環氧基團的樹脂、帶有活性醛的樹脂或帶有金屬離子的樹脂。能夠與相應的重組酶(酶蛋白)直接作用，將重組酶偶聯到樹脂上，從而起到更好的固定重組酶的效果。作為進一步的優選，所述帶有環氧基團的樹脂可以選自采用如西安藍曉科技新材料股份有限公司的Seplite LX-1000EP或Summit PharmaceuticalsInternat1nal的EP113/M等；所述含有活性醛的樹脂如選自經戊二醛活化的LX-1000EA或LX-1000HA等；所述含金屬離子的樹脂如用Ni離子或鈷離子活化的S印lite LX-1000