一種新型中溫α-淀粉酶的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種新型中溫α-淀粉酶的應用。氨基酸序列為SEQ ID NO.1所示的α-淀粉酶AmyM在處理淀粉制備富含麥芽六糖糖漿方面的應用。其中，所述的糖漿組分組成為：麥芽四糖以上低聚糖含量50％以上；麥芽三糖含量8-10％，麥芽糖含量低于6％，其他低聚糖低于35％。本發明淀粉酶制得的糖漿與現有的麥芽六糖糖漿相比，葡萄糖含量較低，麥芽六糖含量更高，酶處理后糖組分相對單一，應用性更廣，且由于本發明涉及到的新型α-淀粉酶 AmyM的優良特性，使得低聚糖的制備過程簡單，產物易純化。
【專利說明】-種新型中溫α-淀粉酶的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于淀粉及淀粉糖制品制備技術、食品添加劑技術和含淀粉產品處理領 域，涉及一種新型中溫α-淀粉酶的應用，具體涉及一種新型中溫α-淀粉酶在處理各種淀 粉制備富含麥芽六糖糖漿的應用。
【背景技術】
[0002] 低聚麥芽糖一般指由3 -9個單糖組成的聚合體，包含麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五 糖以及麥芽六糖等。低聚麥芽糖漿主要采用優質玉米淀粉，經過淀粉酶水解而制得的糖漿， 產品甜度低，口感佳。經過酶水解制備的低聚麥芽糖，食用后血糖上升緩慢，且發熱量低，對 于糖尿病、心血管患者以及肥胖者都有較好的保健作用。低聚麥芽糖引起的胰島素反應平 穩，克服了運動中服用單、雙糖引起的回躍性低血糖反應，在運動飲料中具有重要的應用前 景。生產高麥芽六糖含量糖漿由于所用的淀粉酶的性質的原因，產量較低，目前市場上富含 麥芽六糖糖漿 7 y'才U 3' G67,其麥芽六糖/七糖總含量只有40%左右。而其他非產麥芽 六糖的α -淀粉酶制備的糖漿其麥芽低六糖含量一般低于30%。
[0003] 麥芽低聚糖（3-6糖）可以阻止面包存儲過程中支鏈淀粉的重結晶，改善面包品 質。面包等面制品加工過程中淀粉顆粒在高溫下會發生糊化，在冷卻/存儲過程中其中的 支鏈淀粉會重新結晶，從而導致面包變硬，貨架期縮短。在面包等面制品中添加高產麥芽六 糖的中溫淀粉酶可以產生大量麥芽六糖等低聚麥芽糖，增加發酵率，改進產品的體積和質 地，改變面制品的口感，延長面制品的保鮮時間。1955年美國FDA和英國1963年分別經過 "公認無害"(General Recognized As Safe, GRAS)驗證后，真菌淀粉酶允許作為面包添加劑 用于面包工業中。但真菌淀粉酶產物是麥芽糖，其抑制支鏈淀粉重結晶的效果較差。2009 年，來自于Pseudomonas saccharophila的麥芽四糖酶通過FDA的GRAS認證，作為面包烤 制的添加劑被使用。本發明發現的高產麥芽六糖的新型中溫淀粉酶由于其高產麥芽六糖活 性，具有作物面包烤制添加酶的潛力。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種新型中溫α-淀粉酶的應用。
[0005] 本發明所述的目的可通過以下技術方案實現：
[0006] 本發明所述的α -淀粉酶AmyM為申請日為2013年2月4日，專利號為"ZL 201310043628. 5"名稱為"一種α-淀粉酶及其基因、含有該基因的工程菌及其應用" 的中國發明專利中請求保護的α -1，4淀粉酶外切酶。該淀粉酶的制備方法詳見"ZL 201310043628. 5"專利說明書實施例1?2。
[0007] 氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的α -淀粉酶AmyM在處理淀粉制備富含麥芽六 糖糖漿方面的應用。
[0008] 其中，所述的糖漿組分組成為：麥芽四糖以上低聚糖含量50%以上；麥芽三糖含 量8-10%，麥芽糖含量低于6% (包括6%)，其他低聚糖低于35% (包括35%)，所述的麥 芽四糖以上低聚糖為4?7個單糖聚合形成的低聚糖；所述的其他低聚糖為八個及以上單 糖聚合形成的低聚糖。
[0009] 所述的糖漿中七糖及以下低聚糖的組成為：G1_葡萄糖3-5% ;G2_麥芽糖5-7% ; 63-麥芽三糖6-8%;64-麥芽四糖7-9%;65-麥芽五糖8-10%;66-麥芽六糖55-60% ; G7-麥芽七糖約4-6%。
[0010] 所述的淀粉的來源優選玉米、小麥、土豆。
[0011] 氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的α-淀粉酶AmyM酶解淀粉產物在制備運動飲 料、發酵飲料和/或啤酒發酵中的應用。
[0012] 麥芽低聚糖可以在不改變食品的原味的情況下可達到食品低甜度化效果。其保 濕、吸濕性能穩定能維持適當的水分，防止烘烤制品中淀粉回生，維持食品的柔軟性、延長 保質期。本發明高產麥芽六糖的a-淀粉酶在制備低葡萄糖、高麥芽六糖含量糖漿方面具 有較好的應用價值，并且可以作為添加劑來延長烤焙面制品的貨架期。
[0013] 有益效果
[0014] 專利號為"ZL 201310043628. 5"雖然公開了 a-淀粉酶具有高酶活，以及中溫特 性、耐鹽性和良好的穩定性，但是并沒有公開其產物的組成。發明人在后續研究中驚喜的發 現該淀粉酶不止具有前述的諸多優點，而且其酶解產物中麥芽六糖占據了很大的比例，超 過50%。且本發明淀粉酶制得的糖漿與現有的麥芽糖糖漿、麥芽四糖糖漿和麥芽六糖糖漿 相比，葡萄糖含量較低，酶處理后糖組分相對單一，應用性更廣，且由于本發明涉及到的新 型a -淀粉酶AmyM的優良特性，使得低聚糖的制備過程簡單，產物易純化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1利用申請號為"201310043628. 5"涉及的a -淀粉酶處理生淀粉產物HPLC分 析
[0016] 圖2利用申請號為"201310043628.5"涉及的a-淀粉酶處理生淀粉后產物中的 寡糖組分HPLC分析
[0017] a圖為麥芽寡糖標準品HPLC分析圖；b圖為AmyM處理生淀粉后水解產物中寡糖組 分HPLC分析圖，其中Ml為葡萄糖，M2為麥芽糖，M3為麥芽三糖，M4為麥芽四糖，M5為麥芽 五糖，M6為麥芽六糖，M7為麥芽七糖。
[0018] 圖3利用申請號為"201310043628.5"涉及的α-淀粉酶處理生淀粉后產物中的 寡糖組分TLC分析
[0019] 其中1 - 7為分別為葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥 芽七糖標準品，8 -10為可溶性淀粉經α -淀粉酶AmyM處理10分鐘，30分鐘和1小時后的 產物組成
[0020] 圖4商業化淀粉酶ΒΑΝ800和新型α -淀粉酶對比處理生淀粉后產物HPLC分析
[0021] 其中a圖：新型α -淀粉酶不同時間（I. 5h，3h，5h，12h)處理生淀粉HPLC圖；b圖： 商業化淀粉酶BAN800與新型α-淀粉酶3h處理生淀粉HPLC圖；c圖：商業化淀粉酶BAN800 與新型α -淀粉酶12h處理生淀粉HPLC圖。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1新型α -淀粉酶的制備
[0023] 詳見中國發明專利201310043628. 5說明書實施例1?2。
[0024] 實施例2.新型α -淀粉酶活性測定及產物薄板層析分析
[0025] I. Oml 0· 5%可溶性淀粉（50mM pH7. OTris - HCl緩沖液）（先加熱到50°C )添加 1 μ 1酶液（原液稀釋10倍后），50°C條件下反應IOmin后，加入2ml DNS即定容到3ml后， 沸水浴5min，冷卻，于OD54tl下測定其吸光值，對照組為熱失活1 μ 1酶液（原液稀釋10倍 后），處理同上。根據葡萄糖標準曲線計算所測淀粉酶活，50°C條件下每分鐘產生1 μ mol的 還原糖所需的酶量定義為一個活力單位。
[0026] 淀粉酶AmyM處理淀粉10分鐘，30分鐘和1小時后利用薄板層析（TLC)分析其產 物組分，TLC條件是：展層劑為正丁醇：甲醇：水=4:2: 1，顯色劑為H2SO4/甲醇（1: 1，v/v)， 顯色條件為90°C烘干lOmin，結果見圖3,發現該酶作用于淀粉后的主要產物是麥芽六糖。
[0027] 實施例3.新型α -淀粉酶水解淀粉產生以麥芽六糖為主的低聚麥芽糖
[0028] 將蠟質玉米淀粉（不限于蠟質玉米），配成8 %的懸浮液，用磷酸緩沖溶液將pH值 調節到6,置于99°C超級恒溫水浴鍋中至完全糊化，之后將完全糊化的淀粉糊冷卻到50°C 后添加 a-amylase AmyM淀粉酶，a - amylase的添加量為淀粉干基的5% (相當于100U 每g干淀粉基質），并分別收集3、12h的產物，酶解12h后升溫到100°C保溫20min滅酶，收 集的產物使用KS803柱分析。色譜柱為Shodex KS - 803 (8mmX 300mm)，檢測器為示差檢測 器。樣品配制成2g/L的溶液，過0. 45 μ m的膜，以超純水為流動相，進樣量20 μ L，流速為 0. 8mL/min，柱溫70°C，檢測器溫度為50°C。
[0029] 玉米淀粉酶解后的產物分析發現（圖1)，四糖以上，52. 24%;三糖，8. 14%，二糖， 5. 94%;其他寡糖，33. 68%。通過對酶解產物HPLC分析其具體麥芽低聚糖組分的相對含量 (圖2)，發現Gl -葡萄糖，3.9% ;G2 -麥芽糖，6. 2% ;G3 -麥芽三糖，8. 1% ;G4 -麥芽四糖， 8.3%;65-麥芽五糖，8.8%;66-麥芽六糖，59.4%;67-麥芽七糖，5.3%。
[0030] 同時選取商業化淀粉酶BAN800作為對比試驗，將上述蠟質玉米淀粉，配成8%的 懸浮液，用磷酸緩沖溶液將PH值調節到6,置于99°C超級恒溫水浴鍋中至完全糊化，之后將 完全糊化的淀粉糊冷卻到70°C后添加 BAN800 a - amylase，淀粉酶添加量和后續檢測分析 方法同上，結果見圖4。
[0031] 產物分析發現商業化淀粉酶BAN800 (購自諾維信公司）水解產物較復雜，在3h生 長低聚糖較少，在12h才趨向穩定，其G6 -麥芽六糖產量明顯低于本發明淀粉酶。
[0032] 實施例4.利用新型α -淀粉酶制備富含麥芽麥芽六糖糖漿
[0033] 利用新型α -淀粉酶制備富含麥芽麥芽六糖糖漿可以在現有的淀粉加工工藝過 程中實現。在配料罐內，把粉漿乳調到25 %?35 %淀粉懸漿，pH值用Na2CO3調到5. 0 -7. 0， 料液攪拌均勻后用泵把粉漿泵入噴射液化器，在噴射其中粉漿和蒸汽直接相遇進行糊化， 出料溫度控制在110 - 115°C，從噴射器中出來的糊化料液降溫至50°C，按IOOU/克干淀粉 的量加入淀粉酶AmyM，保溫處理3小時。終點后，將料液噴射加熱80°C滅酶。首先用過濾 機除渣過濾，再加入活性炭脫色半小時，進行脫色過濾，然后將糖液進行二次脫色，脫色后 進行離子交換。將離交后的糖液用五效降膜式蒸發器濃縮至產品要求。
[0034] 取樣對制備的麥芽六糖糖漿進行產物分析，發現該糖漿麥芽六糖組分占總組分的 約53%，其他寡糖組分占總組分的約4%，其他組分約43%，說明該糖漿主要組分為麥芽六 糖，為富含麥芽六糖糖漿。
【權利要求】
1. 氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的a-淀粉酶AmyM在處理淀粉制備富含麥芽六糖 糖漿方面的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的糖漿組分組成為：麥芽四糖以上 低聚糖含量50%以上，麥芽三糖含量8-10%，麥芽糖含量低于6%，其他低聚糖含量低于 35%;所述的麥芽四糖以上低聚糖為4?7個單糖聚合形成的低聚糖；所述的其他低聚糖為 八個及以上單糖聚合形成的低聚糖。
3. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的糖漿中七糖及以下低聚糖的組成 為：G1-葡萄糖3-5% ;G2-麥芽糖5-7% ;G3-麥芽三糖6-8% ;G4-麥芽四糖7-9% ;G5-麥 芽五糖8-10% ;G6-麥芽六糖55-60% ;G7-麥芽七糖約4-6%。
4. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的淀粉來源于玉米、小麥、土豆。
5. 氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的a-淀粉酶AmyM酶解淀粉產物在制備運動飲料、 發酵飲料和/或啤酒發酵中的應用。
6. 氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的a-淀粉酶AmyM在面包烘培中的應用。
【文檔編號】C12P19/02GK104404107SQ201410713567
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】崔中利, 李周坤, 黃彥 申請人:南京農業大學