交聯固定脂肪酶的超順磁載體的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及食品化學技術領域，尤其涉及一種交聯固定脂肪酶的超順磁載體的制 備方法。
【背景技術】
[0002] 固定化脂肪酶是將脂肪酶通過物理或化學的方法與某種物體結合制備成為不溶 于水的，但仍具有催化活性的復合體，這一過程是將單體的游離脂肪酶轉變成了被某種物 體束縛的復合脂肪酶催化劑。
[0003] 脂肪酶（EC3. 1. 1. 3)在自然界中廣泛存在，工業領域的脂肪酶主要運用于化工、醫 藥、食品等，來源于微生物中。在酶催化反應中，脂肪酶在油水界面具有"界面活性"的特點， 共同的催化活性中心 -即Ser、Asp (Glu)和His構成的三聯體，包埋于一個或數個帶色氨 酸(兩親性）的a-螺旋結構的"蓋子"保護之下，色氨酸疏水面與催化中心疏水結構相結 合，親水部分則暴露于外，當與界面接觸時，"蓋子"被打開，活性中心暴露，底物得以靠近， 同時，酶分子仍然存在一定數量的水，保證其在油水界面的自體激活。因此，兩親性物質如 磷脂、或膽酸鹽等的存在對加速脂肪酶的界面活化具有重要作用。
[0004] 脂肪酶的固定化方法大致分為物理法和化學法：物理法包括吸附法和包埋法；化 學法包括交聯法和共價結合法。交聯法是利用交聯劑對晶體酶或溶解酶交聯后就形成能保 持一定催化活性的交聯酶。
[0005] 中國發明專利CN102286452B公開了一種采用油酸包裹的Fe30 4納米結構，通過與 烯酸酯的聚合，然后與水合肼、亞硝酸依次反應得到活化的疊氮磁性納米結構的固定化酶 載體。由于固定化酶載體是在油酸包裹粒子在烯酸脂中進行共聚反應而進行的包埋，具備 的孔隙，使得疊氮化反應中的NaN0 2、引發劑過硫酸鉀等能夠對以Fe304為核的油酸包裹粒 子造成破壞，導致功能的缺陷。
[0006] 中國發明專利CN103012673B提供了一種生物酶固定化的核殼式超順磁性聚合物 微球的制備方法，用具備較強輕水性的SiOJ# Fe 304納米粒子進行完全包裹，再將表面引入 環氧基團的聚合物，此類固定化酶雖然能夠較好的保留酶活，裝載量有一定的優勢，然而僅 僅能運用于水溶性生物化酶的固定，無法適應脂肪酶界面活化特性。
【發明內容】
[0007] 由于脂肪酶的特殊結構和固定化基團的特殊屬性，固定化的脂肪酶通常剛性結構 增加，通常在一些疏水性載體上表現出更好的活性。本發明目的在于克服現有技術存在的 缺陷，提供一種交聯固定脂肪酶的超順磁載體的制備方法，該超順磁載體是基于脂肪酶界 面活性作用方式的超順磁聚合微球，通過該微球對脂肪酶進行固定，固定化的脂肪酶具備 良好的磁分離性能，保留90%以上的酶活性，克服酶促反應中脂肪酶活依賴界面效應的劣 勢。
[0008] 本發明通過以下技術方案來實現：一種交聯固定脂肪酶的超順磁載體的制備方 法，經過下列各步驟： (1) 納米磁性微球Fe304的制備： 將FeCl3 ? 6H20溶解于無水乙二醇中，配置成濃度為0. 1~0. 15mmol/mL的溶液，再按 FeCl3 ? 6H20與處理劑的質量比為1: (4~6)加入處理劑，其中處理劑為乙酸鈉和聚乙二 醇，加入處理劑后使乙酸鈉的濃度為80~120mg/mL，然后在200°C下恒溫超聲反應4~6h， 待自然冷卻后，用乙醇和去離子水洗滌數次，再經真空干燥即得納米磁性微球Fe 304; (2) 納米磁性微球Fe304的包裹： 將步驟（1)所得納米磁性微球Fe304與濃度為lmol/L的NaOH溶液混合，直至得到納米 磁性微球Fe304的濃度為4~8mg/mL的懸浮液，將懸浮液經超聲波分散均勻，然后加入3倍 懸浮液體積的無水乙醇、加入納米磁性微球Fe 304質量1/5~1/10的包埋劑以及加入懸浮 液體積1/2的氨水，再在100°C下攪拌反應40min得到磁流體，然后將磁流體在1~2T的磁 場條件下靜置完成磁分離，再對磁流體進行固液分離，所得固體用乙醇和去離子水洗滌數 次，即得包裹后的納米磁性微球Fe 304; (3) 納米微球的功能化修飾： 按（0. 2~0. 8) :200的固液比g/mL計，將步驟（2)所得包裹后的納米磁性微球Fe304 超聲分散于甲醇中，再按包裹后的納米磁性微球Fe304與N-異丙基丙烯酰胺的質量比為 (0. 2~0. 8):4. 05加入N-異丙基丙烯酰胺，按包裹后的納米磁性微球Fe304與偶氮二異丁 腈的質量比為（〇. 2~0. 8) :0. 15加入偶氮二異丁腈，得到反應體系，然后將反應體系置于 氮氣保護下以70°C反應12h，后將反應物置于沉淀劑中進行反復沉淀，直到無沉淀析出；將 所得沉淀物進行真空干燥，即得到交聯固定脂肪酶的超順磁載體。所得交聯固定脂肪酶的 超順磁載體為淡黃色或白色的固體粉末，其粒徑為300~400nm。
[0009] 所述步驟（1)或（2)中的乙醇和去離子水洗滌數次是指先用乙醇和去離子水交替 洗滌數次后，再用去離子水洗滌。
[0010] 所述步驟（2)的包埋劑為正硅酸乙酯或海藻酸鉀。
[0011] 所述步驟（3)的沉淀劑為乙醚或正己烷。
[0012] 所述無水乙二醇、乙酸鈉、聚乙二醇、甲醇、N-異丙基丙烯酰胺、偶氮二異丁腈、正 硅酸乙酯、海藻酸鉀、乙醚和正己烷均為市購分析純。
[0013] 本發明所得超順磁載體在使用時，按常規方法固定脂肪酶，即先分散在濃度為 0. 9wt%的氯化鈉溶液或濃度為15~20wt%的乙醇溶液中，再在60°C條件下，加入戊二醛和 脂肪酶進行攪拌，并經磁分離后對固體洗滌，最后經冷凍干燥，即得到固定后的脂肪酶。
[0014] 本發明是使用海藻酸鉀或正硅酸乙酯對納米磁性微球Fe304進行包裹，將其 分散于溶液中形成磁流體，在磁流體中通過聚合合成并修飾溫感聚N-異丙基丙烯酰胺 (PNIPAAm)(經步驟3的修飾，N-異丙基丙烯酰胺會形成聚N-異丙基丙烯酰胺)，加入交 聯劑偶氮二異丁腈生成易于固定脂肪酶的超順磁載體。納米磁性微球Fe 304是一種通過溶 劑沉淀等方法較易制得的粒徑在1~25nm之間的超順磁特性的粒子，在固定化酶方面，具 有較大的比表面積、生物相容性、易回收等特點，因原子都分布于粒子表面，易引入氨基、羥 基、巰基等活性基團，從而實現通過分子間作用力或共價方式對脂肪酶(蛋白質）的交聯而 固定。聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAAm)是一類智能溫感高分子材料，由于其測量上同時具 備親水性的酰胺基基團（-C0NH-)和疏水的異丙基基團[_CH(CH 3)2]，親水的酰胺基團能夠 與周圍的水分子形成氫鍵，并與結構內部的疏水作用力形成相對平衡。在低于臨界溶解溫 度（LCST，32°C )時，氫鍵暴露呈現溶解性，當溫度高于LCST時，氫鍵被破壞，聚N-異丙基丙 烯酰胺（PNIPAAm)分子內作用力增強，形成不溶性的束膠。聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAAm) 這種依賴溫度的結構特性，為構建的界面特征，從而實現控制酶活提供了可能。
[0015] 本發明具備的優點及效果：通過本發明方法制備的超順磁載體，引入溫敏材料聚 N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAAm) (LCST，34°C )，能夠通過控制溫度改變載體的結構特性，從而 使得通過該載體固定后的脂肪酶能夠擺脫界面特性的控制，直接在醇、酸和酯類之間反應， 有利于反應產物的分離；通過引入溫敏材料后的納米粒子，LCST在34°C，低于一般脂肪酶 最佳活性溫度（50°C)，有利于通過a蓋控制酶活性，通過控制溫度高于LCST，形成虛擬的 界面性質，打開a蓋，激活脂肪酶。該超順磁載體是基于脂肪酶界面活性作用方式的超順 磁聚合微球，通過該微球對脂肪酶進行固定，固定化的脂肪酶具備良好的磁分離性能，保留 90%以上的酶活性，克服酶促反應中脂肪酶活依賴界面效應的劣勢。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步的說明： 實施例1 (1) 納米磁性微球Fe304的制備： 將FeCl3 ? 6H20溶解于無水乙二醇中，配置成濃度為0. 13mmol/mL的溶液，再按 FeCl3 ? 6H20與處理劑的質量比為1:6加入處理劑，其中處理劑為乙酸鈉和聚乙二醇，加入 處理劑后使乙酸鈉的濃度為95mg/mL，然后轉移至涂有惰性材料聚四氟乙烯的反應器中，在 200°C下恒溫超聲反應5h，待自然冷卻后，先用乙醇和去離子水交替洗滌數次后，再用去離 子水洗滌，再經真空干燥即得納米磁性微球Fe 304; (2) 納米磁性微球Fe304的包裹： 將步驟（1)所得納米磁性微球Fe304與濃度為lmol/L的NaOH溶液混合，直至得到納米 磁性微球Fe304的濃度為8mg/mL的懸浮液，將懸浮液經超聲波分散均勻，然后加入3倍懸浮 液體積的無水乙醇、加入納米磁性微球Fe 304質量1/5的海藻酸鉀以及加入懸浮液體積1/2 的氨水，再在l〇〇°C下攪拌反應40min得到磁流體，然后將磁流體在1~2T的磁場條件下靜 置完成磁分離，再對磁流體進行固液分離，所得固體先用乙醇和去離子水交替洗滌數次后， 再用去離子水洗滌，即得包裹后的納米磁性微球Fe 304; (3) 納米微球的功能化修飾： 按0. 6:200和固液比g/mL計，將步驟（2)所得包裹后的納米磁性微球Fe304超聲分散于 甲醇中，再按包裹后的納米磁性微球Fe304與N-異丙基丙烯酰胺的質量比為0. 6:4. 05加入 N-異丙基丙烯酰胺，按包裹后的納米磁性微球Fe304與偶氮二異丁腈的質量比為0. 6:0. 15 加入偶氮二異丁腈，得到反應體系，然后將反應體系置于氮氣保護下以70°C反應12h，后將 反應物置于乙醚中進行反復沉淀，直到無沉淀析出；將所得沉淀物進行真空干燥，即得到交 聯固定脂肪酶的超順磁載體。所得交聯固定脂肪酶的超順磁載體為淡黃色的固體粉末，其 粒徑為300~400nm。
[0017] 所得超順磁載體0. 5g分散在濃度為0. 9wt%的氯化鈉溶液中，再在60°C條件下，加 入5mL YZ02脂肪酶（Bacillus pumilus，酶活為600U)和10ml的戊二醛，于反應釜中攪拌 2h，并經磁分離后用乙醇對固體洗滌，最后經冷凍干燥，即得到固定后的脂肪酶。通過對硝 基苯酚法測定，固定化酶活