一株高產厚垣孢子的綠色木霉及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物防治植物病害領域。具體而言，本發明涉及一種高產厚垣孢子的 綠色木霉菌株及其應用。
【背景技術】
[0002] 木霉（Trichoderma spp.)，屬于半知菌類的絲孢綱、叢梗孢目、叢梗孢科，是一類 廣泛分布于土壤、空氣、枯枝落葉及各種發酵物上的真菌，從植物根圈、葉片及種子、球莖表 面均可以分離到。木霉通過產生抗生素、營養競爭、重寄生、細胞壁降解酶以及誘導植物產 生抗性等機制，對于多種植物病原菌具有拮抗作用，可抑制多種植物病害，是目前生防菌株 中研究最為廣泛的菌株之一。木霉對植物病原菌的生物防治機制是多樣而復雜的，常常是 多種機制共同作用的結果，不同的菌株生防機制的側重點不同，其生防作用效果與菌株類 型、病原真菌的類型、作物類型和環境條件密切相關。但由于木霉菌孢子不具備抗逆性，在 高溫、干燥和強光下就會死亡，失去抑菌活性。實驗表明，一般不經過特殊處理的木霉菌孢 子，在常溫下（25°C )，相對濕度80%，存活時間只有12天，添加保水劑和紫外線防護劑，其 存活時間只有2個月。因此，獲得具有產生抗逆性很強的厚垣孢子產生菌就具有特殊意義。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種高產厚垣孢子的綠色木霉菌株TW12,該菌株不僅能夠 產生抗逆性很高的厚垣孢子，而且對黃瓜灰霉病、菌核病和柑橘炭疽病都具有很高防治效 果。本發明的綠色木霉菌株不僅生長速度快、產孢量大、作用譜廣，而且厚垣孢子生成率超 過45%，大大增加了抗逆性，儲存時間長，且具有在黃瓜葉片、柑橘葉片能夠快速大量定殖 等特點，因此具有良好的應用前景。
[0004] 本發明所提供的菌株為綠色木霉（Trichoderma viride)菌株TW12,是從濰坊北 部渤海灘涂潮間帶的枯木上分離獲得的，已于2015年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國 科學院微生物研究所），保藏編號為CGMCC No. 11048。其具有以下生物學特性：在PDA瓊脂 培養基上生長快，32°C黑暗條件下培養2d，菌落直徑75mm。菌落初期白色稀疏，后期形成黃 綠色產孢區，3d即形成大量綠色孢子。反面無色。菌絲聚隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式 的分枝輪廓，分枝末端的小梗束生、對生、互生或單生，瓶形，4. 5-10X2. 5-3. 5 μπι。分生孢 子橢球形、單個，近無色，聚集時呈淡綠色，壁稍粗糙，3. 5-5 X 3-4 μ m。
[0005] 本發明綠色木霉菌株TWl2的培養方法或繁殖方法包括：
[0006] (1)普通培養保存采用PDA培養基，配方為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂12g，蒸 餾水 1000 mL ;
[0007] (2)實驗室液體培養采用PDB培養基，配方為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水 1000 mL ；
[0008] (3)固體培養基配方：固料和無機鹽溶液，所述固料和無機鹽溶液的質量比為1 : I. 8 ;所述固料由質量比為60 :10 :30的木粉、玉米粉和麩皮組成；按質量百分比計，所述 無機鹽溶液的組分及含量為：3. 5%磷酸二氫鉀，0. 05%硫酸鎂，0. 5%硫酸鈣，4%硫酸銨， 0. 05%氯霉素，1. 3%輕質碳酸|丐，剩余為水。
[0009] (4)大量發酵培養基配方：同（3)中固體培養基配方。
[0010] 本發明還提供了一種含有所述綠色木霉菌株TW12的生物防治制劑。
[0011] 本發明所述的生物防治制劑的制備方法包括以下步驟：
[0012] (1)制備所述綠色木霉菌株TW12的種子液；
[0013] (2)將步驟（1)制備的種子液接種到固體培養基中，28_30°C下恒溫培養3~5d ;
[0014] (3)將步驟（2)培養的培養物加入無菌水混合，過濾，將濾液接種至大量發酵培養 基，在室溫28-30°C、相對濕度85%以上的發酵室中進行發酵培養。
[0015] 其中，步驟（2)中的固體培養基由固料和無機鹽溶液組成，所述固料和無機鹽溶 液的質量比為I :1. 8 ;所述固料由質量比為60 :10 :30的木粉、玉米粉和麩皮組成；按質量 百分比計，所述無機鹽溶液的組分及含量為：3. 5%磷酸二氫鉀，0. 05%硫酸鎂，0. 5%硫酸 鈣，4 %硫酸銨，0. 05 %氯霉素，1. 3 %輕質碳酸鈣，剩余為水。
[0016] 并且，步驟（3)中的大量發酵培養基同固體培養基。
[0017] 在本發明的一個具體實施方案中，所述制備方法包括以下步驟：
[0018] (1)將所述綠色木霉菌株TW12的孢子移植到PDB液體培養基中，28-30°C搖床振蕩 培養2~3d得到種子液；PDB液體培養基配方：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000 mL ;
[0019] (2)將步驟（1)制備的種子液按質量比15%的比例接種到固體培養基中，28_30°C 下振蕩培養3~5d，期間維持相對濕度85%以上；
[0020] (3)將步驟⑵培養的培養物加入無菌水按質量比1 :15的比例混合，過濾，將濾 液按體積比1 :6的比例接種至大量發酵培養基，室溫28-30°C、相對濕度85%以上的發酵室 中發酵培養8~9d。
[0021] 本發明還提供了上述綠色木霉菌株TW12或者上述生物防治制劑在防治黃瓜灰霉 病、黃瓜菌核病和柑橘炭疽病中的用途。
[0022] 并且，本發明還提供了一種用于防治黃瓜灰霉病、黃瓜菌核病和柑橘炭疽病的生 物防治方法，所述生物防治方法包括向發病的黃瓜葉片、柑橘施用上述綠色木霉菌株TW12 或者上述生物防治粉劑或液體制劑。
[0023] 實驗表明，本發明的綠色木霉菌株具有生長速度快、產孢量大、作用譜廣、厚垣孢 子產生率大，抗逆性強，在黃瓜、柑橘葉片能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應用 前景。由該綠色木霉菌株TW12制備的生物防治制劑，可以作為防治黃瓜病害的生物農藥或 生物肥料，防治多種黃瓜灰霉病、黃瓜菌核病和柑橘炭疽病等。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是示例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0025] 實施例1
[0026] 1、綠色木霉菌株TW12的分離與純化
[0027] 本發明的綠色木霉菌株TW12是從濰坊北部渤海灘涂潮間帶的枯木上分離獲得 的，分離方法為：
[0028] ⑴木霉菌株的分離：取潮間帶枯木殘體，先用75%的酒精局部處理lmin，再在超 凈工作臺上用紫外燈處理20min后，用滅菌刀片切開處理部位，用接種針挑取少量枯木刮 取物，在PDA平板上劃線，定時觀察菌落生長情況。然后采用平板劃線法，純化木霉菌株，轉 至PDA試管斜面保存備用。
[0029] (2)厚垣孢子產生率測定：首先在顯微鏡下進行形態觀察，再進行高溫活性測試， 確定厚垣孢子抗逆性。
[0030] (3)黃瓜灰霉病和柑橘炭疽病高效拮抗木霉菌株的篩選
[0031] ①初篩：采用對峙培養法，制備PDA平板，用打孔器在木霉菌、黃瓜灰霉病菌、柑橘 炭疽病病菌邊緣打取直徑為5mm的菌餅，分別移植在平板相對的兩側中央，26°C恒溫培養， 逐日觀察木霉菌對病原菌的抑制作用。
[0032] ②復篩：將篩選到的具有高效拮抗活性的木霉菌株進行復篩，主要是經過耐溫性、 耐酸堿性、耐藥性試驗，篩選到耐性較好的木霉菌株，進行盆栽防治試驗和田間試驗。
[0033] 本發明人通過大量篩選工作得到一株能夠高效防治黃瓜灰霉病、菌核病和柑橘炭 疽病的綠色木霉（T. viride)TW12。實驗證明，該綠色木霉原粉在防治黃瓜病害的代表性大 棚種植試驗中，對黃瓜灰霉病和柑橘炭疽病都顯示出非常高效的防治效果，使得農作物顯 著增產。因而，本發明的綠色木霉是具有廣泛應用前景的綠色木霉新菌株，可以用于制備防 治黃瓜等病害的生物防治制劑。
[0034] 2、菌株鑒定
[0035] (1)微生物學特性：在PDA瓊脂培養基上生長快，32°C黑暗條件下培養2d，菌落直 徑75mm。菌落初期白色稀疏，后期形成黃綠色產孢區，3d即形成大量綠色孢子。反面無色。 菌絲聚隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式的分枝輪廓，分枝末端的小梗束生、對生、互生或單 生，瓶形，4. 5-10X2. 5-3. 5 μ m。分生孢子橢球形、單個，近無色，聚集時呈淡綠色，壁稍粗 糙，3. 5-5 X 3-4 μ m〇
[0036] (2)分子生物學特性
[0037] 該菌株的rRNA基因序列測定結果（ITS-5. 8S-ITS2區）如下（SEQ-I):
[0038] GGGCCCGGGATCTACTGATCGAGGTCACATTTCAGAAGTTTGGGGTGTTTACGGCTGTGGCCGCGCC GCGCTCCCGGTGCGAGTGTGCAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCCGGGGCGGC CCGGTGAGGGGCCGATCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCC CGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTA TCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGCTTTGATTCATTTTCGAGA CGCCCGCTAGGGTCGCCGAGAAAGGCTCAAGCAAAAATAAAACAGAGCCGCGACGGGAGCCGCGACGGAGAGAAA AAAGAGTTGGAGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCATGGGATCCGGGGCTGCGACGCGCCCGGGGCAAGAGAATCCCG CCGAGGCAACAGATTGGTAACGTTCAATTGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCA CCAACGGAGACCTTGTTACGTT
[0039] 其中，PDA培養基配方：馬鈴薯200g (去皮），葡萄糖20g，瓊脂12g，蒸餾水1000mL。
[0040] 實施例2
[0041] 1、綠色木霉菌株TW12的發酵過程
[0042] PDB培養基配方：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。
[0043] 大量固體發酵培養基配方：所述固料和無機鹽溶液的質量比為I :1. 8 ;所述固料 由質量比為60 :10 :30的木粉、玉米粉和麩皮組成；按質量百分比計，所述無機鹽溶液的組 分及含量為：3. 5 %磷酸二氫鉀，0. 05 %硫酸鎂，0. 5 %硫酸鈣，4 %硫酸銨，0. 05 %氯霉素， 1.3%輕質碳酸鈣，剩余為水。
[0044] 綠色木霉菌株TWl2大量固體發酵過程：
[0045] ①菌種種子液培養：將綠色木霉菌菌株TW12從試管斜面中挑取少量孢子，移至 PDB液體培養基中，28 °C搖床振蕩培養3~5d，此為種子液。
[0046] ②固體生產菌種的培養：將種子液按15%的比例接種到固體培養基（500mL三角 瓶）中，28°C恒溫培養3~5d，中間多次振蕩；期間維持相對濕度85%以上，產孢濕度75~ 80% ；
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