一種嘧啶核苷磷酸化酶基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術及生物醫藥領域，涉及一種嘧啶核苷磷酸化酶基因及其應 用，具體涉及一類嘧啶核苷磷酸化酶及其基因，及含有該嘧啶核苷磷酸化酶基因的重組表 達載體和基因工程菌，并用于催化合成索非布韋中間體（2' R)-2' -脫氧-2' -氟-2' -甲基 脲苷，以及其他核苷類原料藥及醫藥中間體的生產。
【背景技術】
[0002] 索非布韋（sofosbuvir，商品名Sovaldi)是美國Gilead Sciences公司研發的口 服治療丙肝（HCV)藥物，于2013年12月經FDA批準上市。索非布韋是首個獲得批準用于 丙型肝炎全口服治療方案的藥物，是全球第一個上市的HCV聚合酶核苷類抑制劑，通過作 用于HCVNS5B聚合酶靶點干擾病毒遺傳物質RNA的合成，從而終止HCV病毒的RNA鏈復制， 并對多種基因型HCV有治療效果，單獨應用索非布韋或與NS5A蛋白酶抑制劑合用，丙肝患 者服用12周持續病毒學應答率達到95%以上，臨床效果顯著，被醫學界視為治療丙型肝炎 的突破性藥物。據世界衛生組織統計，全球丙肝的感染率約為3%，約1. 8億人感染HCV，丙 肝呈現全球化流行趨勢。索非布韋上市僅一年多，其銷售額即過百億美元，成為史上最快達 到年銷售百億美元的藥品。
[0003] 索非布韋是尿嘧啶核苷類似物的前藥，分子式為C22H29FN 3O9P,分子量529. 45, CAS 登記號為 1190307-88-0。中文化學名為（S)-2-(((S)-(((2R，3R，4R，5R)-5-(2,4-二氧 代-3,4-二氫嘧啶-I (2H)-基]-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基）甲氧基）（磷酰 化苯氧基）氨基）丙酸異丙酯；英文化學名稱為（S)-isopropyl 2-{ (S) _{{(2R，3R，4R，5R) -5-[2, 4-diox0-3, 4-dihydr0-pyrimidin-l(2H)-yl]-4-fluor〇-3-ydroxy-4-methyltetra hydrofuran-2-yl}methoxy}(phenoxy phospho-ryla-mino}pr〇-panoate〇
[0004] 核苷類似物的合成主要有化學合成法、堿基修飾法和生物轉化法三種，前兩種方 法工藝步驟多，反應條件苛刻，需要進行異構體的分離；堿基和核糖基團縮合時還需要進行 基團的保護和去保護，使合成反應的總收率偏低，成本居高不下（MENG W，ELLSWORTH B A， NIRSCHL A A,et al. J Med Chem,2008,51(5):1145-1149. CARR R,HILDBR AND S,HODGES M L，et al.WO, 2013178571 Al. 2013-11-05)。而酶催化合成方法具有反應條件溫和、反應專 一性強、副反應少、產物容易分離純化，可合成復雜的生物分子，無需基團保護等優點。目 前，嘧啶核苷磷酸化酶已被廣泛用于酶法合成抗腫瘤、抗病毒的核苷類似物。
[0005] 核苷磷酸化酶（Nucleoside Phosphorylase，NPase)是核苷補救代謝途徑中的 關鍵酶，廣泛存在于真核或原核生物中，可分為噪呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylas，PNPase，EC2. 4· 2. I)，尿苷磷酸化酶（uridine phosphorylase， UrdPase, EC2. 4· 2· 4)和胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，dThdPase，EC2. 4· 2· 3)。 核苷磷酸化酶能可逆地催化核苷（或脫氧核苷）磷酸化反應。目前，利用核苷磷酸化酶已 成功合成了阿糖腺苷、利巴韋林、5-甲基尿苷等藥物。但利用含有核苷磷酸化酶的天然菌株 合成核苷類藥物存在酶量小的缺點，構建基因工程菌可從解決酶量問題。
[0006] 核苷磷酸化酶催化的化學反應如下：
[0009] 本發明開發了一個具有較高催化活性的嘧啶核苷磷酸化酶，可用于索非布韋中間 體的生產，以及相關核苷類原料藥及醫藥中間體的生產。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種嘧啶核苷磷酸化酶基因及其 編碼的蛋白。
[0011] 本發明的另一目的是提供該基因、含有該基因的重組質粒及基因工程菌的應用。
[0012] 本發明的又一目的是提供一種催化合成（2' R) -2' -脫氧-2' -氟-2' -甲基脲苷的 方法。
[0013] 本發明的目的可通過如下技術方案實現：
[0014] -種嘧啶核苷磷酸化酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發明中嘧 啶核苷磷酸化酶的基因序列來源可以為大腸桿菌Escherichia Coli)、產氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes)、芽抱桿菌（Bacillus)、微桿菌（Exiguobacterium)、胡蘿卜軟 腐歐文氏菌（Erwinia carotovora)、乙酰短桿菌（Brevibacterium actylium)、短乳桿菌 (Lactobacillus brevis)等。本發明的一個實施例中啼啶核苷磷酸化酶的基因序列來自大 腸桿菌。嘧啶核苷磷酸化酶基因可以通過PCR擴增法、重組法或者化學合成方法獲得。
[0015] -種嘧啶核苷磷酸化酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0016] 含有本發明所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的重組載體。可通過本領域常規方法 將本發明的嘧啶核苷磷酸化酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構建而成，如質粒 pUC18, pUC19, pET系列等，更優選地選自pET系列。本發明的一個實施例中所使用的質粒 為 pET-28a(+)。
[0017] -種生產所述的嘧啶核苷磷酸化酶的基因工程菌，所述基因工程菌中包含所述的 嘧啶核苷磷酸化酶基因或所述的重組載體。
[0018] 所述基因工程菌的宿主細胞優選為大腸埃希氏菌（Escherichia coli) BL21(DE3) 〇
[0019] 本發明所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因、所述的重組載體、所述的基因工程菌在制 備嘧啶核苷磷酸化酶中的應用。
[0020] -種嘧啶核苷磷酸化酶的制備方法，包括如下步驟：培養所述的基因工程菌，獲得 重組表達的嘧啶核苷磷酸化酶。
[0021] 所述的方法，優選還包括在一定生產罐發酵條件下，進行工業化制備所述嘧啶核 苷磷酸化酶的步驟。
[0022] 本發明所述的嘧啶核苷磷酸化酶在催化合成（2'R) _2'_脫氧_2'_氟_2'_甲基脲 苷中的應用。
[0023] -種利用本發明所述的嘧啶核苷磷酸化酶催化合成（2' R)_2' -脫 氧-2' -氟-2' -甲基脲苷的方法，以（3R，4R，5R) -3-氟-4-羥基-5-(羥甲基）-3-甲基四 氫呋喃-2-二氫磷酸和尿嘧啶為底物，權利要求2所述的嘧啶核苷磷酸化酶為催化劑，催化 合成（2' R) -2' -脫氧-2' -氟-2' -甲基脲苷。
[0024] 有益效果：
[0025] 本發明通過易錯PCR和定點突變方法獲得了 SEQ ID NO. 1所示的嘧啶核苷磷 酸化酶基因變體，通過將該基因導入大腸桿菌構建基因工程菌，并進行誘變表達，獲得 了 SEQ ID NO. 2所示的重組嘧啶核苷磷酸化酶。重組嘧啶核苷磷酸化酶突變體的酶 活為612U/mg，比突變之前提高了 30-60%。該重組嘧啶核苷磷酸化酶能夠用于催化 (3R，4R，5R)-3-氟-4-羥基-5-(羥甲基）-3-甲基四氫呋喃-2-二氫磷酸和尿嘧啶合成索 非布韋中間體（2' R)-2' -脫氧-2' -氟-2' -甲基脲苷。 生物材料保藏信息 本發明基因工程菌分類命名為大腸桿菌NP1506Escherichia coli NP1506,2015年 12月25日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為 CCTCC NO :M 2015782。
【具體實施方式】
[0026] 根據本發明一個實施例的嘧啶核苷磷酸化酶基因，其來源大腸桿菌 (Genbank:NC_000913. 3)。根據易錯PCR和定點突變方法對其進行突變，從而獲得該重組氨 基轉移酶突變體目的基因，其基因序列為SEQ ID NO. 1。
[0027] 根據本發明一個實施例的嘧啶核苷磷酸化酶突變體的蛋白序列為SEQ ID NO. 2。
[0028] 根據本發明一個實施例的重組載體，包括本發明實施例的嘧啶核苷磷酸化酶突變 體基因，載體為pET-28a(+)，采用乳糖啟動子。基因工程菌搖瓶培養的誘導劑為IPTG，嘧啶 核苷磷酸化酶制備的誘導劑為乳糖。
[0029] 根據本發明一個實施例的生產嘧啶核苷磷酸化酶突變體的基因工程菌具有包括 嘧啶核苷磷酸化酶多肽基因突變體的重組載體。
[0030] 具體地，本發明的基因工程菌為保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC)的保藏 編號為CCTCC M 2015782的基因工程菌。
[0031] 實施例1基因工程菌的建立
[0032] 根據Genebank公布的大腸桿菌啼啶核苷磷酸化酶基因（Genbank:NC_000913. 3)， 人工合成嘧啶核苷磷酸化酶基因片段，以該基因片段為模版，通過PCR擴增擴 展該片段（片段兩側加 BamH I和EcoR I內切酶片段），其核苷酸序列如SEQ ID N0.3(Genbank:NC_000913.3)所示。并利用 Hind III 和 BamH I 內切酶位點 將基因插入pET-28a(+)質粒中，將連接后的載體轉入大腸桿菌BL21 (DE3)中 建立嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌。其中PCR擴增嘧啶核苷磷酸化酶基因的 引物為：上游引物為5' -GTCTGATGTTTTTCATCTCG-3'（SEQ ID NO. 4)，下游引物為 5'-CCCGTTTTCCCGCTGGCTTT-3'（SEQ ID NO. 5)。
[0033] 實施例2嘧啶核苷磷酸化酶突變體基因的獲得
[0034] 本研究利用易錯PCR和定點突變的方法，對嘧啶核苷磷酸化酶進行了蛋白質工程 改造。易錯PCR是在采用DNA聚合酶進行目的基因擴增時，通過調整反