專利名稱：調控玉米氮吸收利用和干旱脅迫基因os1及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物分子生物學和植物遺傳工程學領域。本專利涉及的基因參與了玉米氮素感應、吸收等生物學途徑，同時調節玉米的抗旱性，通過對該基因的深入研究能夠提高玉米和其它農作物氮素吸收效率和抗旱性能。
背景技術：
氮是植物生長發育過程中重要的營養元素，氮占植物總干物質重量的1.5-2%， 氮元素是植物不同組織大分子物質的重要組成元件，如蛋白質、核酸、葉綠體等，因此，植物必須從土壤中吸收足夠的氮營養來滿足自身的生長發育(Marschner，1995)。植物吸收氮的形式包括有機氮(oganic nitrogen)和無機氮(inoganic nitrogen)兩種類型，其中豆科(legume)作物可以通過固氮菌(Rhizobium)利用多種形式的氮(Vance, 1992 ；Burris, 1993 ；Schauser, 1999) ο硝態氮(nitrate)和銨態氮(ammonium)等無機氮源是植物吸收和利用主要形式(Hageman, et al.，1988 ；Lawlor, et al.，1989)，對農作物的生長發育包括葉綠體形成、根的生長以及作物的產量形成有著至關重要的作用(1am，1996 ;LaWler，et al.，2001)。植物缺氮的情況下會表現為光合能力和光合效率減低，結果造成植物生長受阻以及作物產量下降，這主要歸因于葉綠體、二磷酸核酮糖羧化酶(ribulose bisphosphate carboxylase)等光合元件受阻(Delgado, et al.，1994)。在農業生產當中，為了保證農作物的產量，氮肥的用量不斷加大(Frink，et al.，1999)，但是利用效率并沒有得到提高，造成50-70%氮肥不能夠被農作物吸收(Peoples，et al.，1995)，這在一等程度上造成資源的白白浪費，同時給環境帶來了一定的壓力，并引起嚴重的環境氮源污染(zhu，2000 ；Good, et al.，2004)，在農作物玉米中已經證實通過提高植物的耐低氮特性并減少氮肥的使用量來保持或增加作物產量(Tollenaar，1999)，近年來，通過對早期的玉米雜交種和當前的雜交種的產量研究證明，與早期的玉米雜交種相比(Castleberry et al. , 1984 ；McCullough et al.，1994)，新培育出的雜交種在低氮環境條件下能夠更好的生長(Duvick，1984，1997 ； Ding et al.，2005)。因此，隨著植物基因組學研究的不斷深入，尋找并克隆氮吸收調控相關基因，開展植物氮元素吸收和轉運過程的調節機制、信號傳導途徑等研究是提高氮營養高效的很好途徑。氮在植物的生長發育過程中不但是重要的營養來源，同時還是重要的信號物質， 該物質調節植物生長發育過程中的葉形態發育、主根和側根結構、開花期和莖分支生成等重要生理過程(Crawford，et al.，2002)，同時還調節氮和碳代謝過程相關基因的表達 (Crawford, 1995 ；Stitt, 1999)。植物生長的土壤環境往往會受到雨水沖蝕、微生物消耗等原因使得氮素含量水平浮動很大，因此，植物必須通過多種自身調節機制來適應這種氮素水平變化(Good，et al.，2004)。當環境中的氮水平降低到一定程度的時候，植物就會通過某種機制來調控自身的生長來適應氮素的脅迫(Meiet al. ,1984 ；Khamis et al., 1990)，如延緩生長(Bongue-Bartelsman et al. , 1995 ；Ono et al.，1996)、降低光合效率 (Geiger et al.，1998)、自身成熟組織的氮素重新利用(Chalker-Scott，1999)、積累大量花青素等(Ding et al.，2005 ；Diaz et al. ,2006) Daniel等2005年研究發現，高親和硝酸轉運蛋白(high-affinity nitrate transporter)基因NRT2. 1突變以后，植物對氮的吸收以及植株中的氮含量明顯降低，同時突變體中的側根補野生型要多，即使在不含氮的培養基中也會有同樣的特點，這表明突變體的表型與硝態氮的有無、含量高低沒有關系，最終結果表明，野生型中，NRT2. 1表現為抑制側根的發生，同時這種結果并不依賴硝態氮吸收和利用，推測該基因可能的功能是一個氮感知因子，或者是一個協調根系統發育的信號傳遞因子(Little，2005) ；Remans等 2006年通過研究發現，NRT1. 1基因突變后，擬南芥的根結構發生變化，不能夠感應到土壤中的硝態氮，從而抑制擬南芥的側根生長發育，這種表型的出現不是因為根的硝態氮吸收水平降低，同時也不是氮形式(銨態氮)不同，而是因為氮信號傳導途徑中的重要基因 ANRl的表達量顯著降低所致，進一步研究發現，NRT1. 1基因是通過調控硝態氮信號傳導過程相關基因來影響根的結構，根結構的變化最終影響土壤環境中的氮營養的吸收(Remas， 2006) ；Peng等2007年，對200個擬南芥T-DNA插入突變體進行篩選得到nla(nitrogen limitation adaptation)突變體，該突變體在氮脅迫的情況下(氮含量小于3mM)與野生型相比表現為極度早衰，在磷脅迫和高溫脅迫下突變體和野生型沒有表型差異，說明該基因是僅僅受氮的調控，進一步的研究表明發現該基因編碼一個環型泛素連接酶(Ring-type ubiquitin ligase)，在野生型中，NLA蛋白與泛素結合酶8相互作用點狀分布在細胞核中， 突變體中nla蛋白由于該結合功能喪失不能夠與泛素結合酶8結合最終造成在低氮情況下出現早衰等氮脅迫表現型(Peng, et al.，2007)；Castaings等2009年，通過T-DNA插入進行大規模的突變體篩選，在擬南芥中的到了 NLP7基因(NIN-Like protein7)，當該基因突變失活后，突變體中的硝態氮的含量比野生型明顯偏高，但是總氨基酸含量、硝酸還原酶活性和谷氨酸合成酶活性在突變體中有所降低，與野生型相比表現為缺氮，同時突變體的抗旱性得到明顯提高。通過進一步研究表明，該基因失活后，氮的傳遞信號被中斷，不能夠感應外界環境中的氮水平，最終造成突變體表現為氮脅迫的表型，亞細胞定位研究表明該基因定位在細胞核中，可能參與到氮吸收利用的下游基因的調控等。近年來，在模式植物擬南芥中對氮的感知、信號傳遞、以及不同氮水平的響應等機制的基因表達調控網絡取得了很大進展，在高氮水平條件下通過NRT1. 1來感應細胞外界環境的硝酸根離子(N03-)，并負責把氮轉移到細胞內部，在細胞內部，氮進一步調節氮相關調節、感應基因NIA，NIR和NRT2. 1等來調節自身的生長發育狀態，如主根和側根的發育、 蛋白質合成、籽粒休眠、氨基酸合成等一些列生理生化過程；在低氮情況下，NRT2. 1首先感應并轉運細胞外界氮(N03-)，在細胞內部，低水平的氮通過調控miR169來增加植物的抗旱性；同時還通過調節氮脅迫響應基因NLP7和NLA的表達來調控下游基因進而來適應氮脅迫環境，氮作為信號調節物質來調控上百種基因的表達，從而來調節自身的生理過程、代謝過程、生長過程和發育過程，盡管很多感知氮的水平基因已經被克隆，然而我們對植物感知、 傳遞氮信號分子機制的了解還很少。含有RWP-RK保守結構域的蛋白在C端有大約40-60個氨基酸保守區段，該保守區域最早在百脈根中發現，同時在擬南芥和水稻中也很保守(Schauser，1999，2005)，百脈根是重要的豆科植物，同時也是很好遺傳研究的模式材料(Handberg，1992)，豆科作物的根可以和土壤中的固氮菌形成一種共生關系，通過特殊的信號傳遞過程，固氮菌就在跟中生長形成根瘤，同時吸收土壤和環境中的氮，同時把這些氮提供給植物，然后植物把光合產物C 提供給固氮菌，相互提供營養。在這共生過程中NIN基因(nodule inception)起著很重要的信號感應和傳導功能，百脈根(L. japonicus)中的基因NIN和萊茵衣藻(Chlamysomonas) 中的 Mid 基因都有 RWP-RK 保守區域(Ferris, et al. , 1996 ；Ferris, et al·，1997)，在萊茵衣藻中Mid基因在萊茵衣藻的配子體發育過程中決定負(-,minus gametes)的發育， mid基因啟動負配子發育相關基因的表達，同時抑制正配子相關基因的表達，該基因在1萊茵衣藻配子體發育的整個過程中起著重要的調控作用，萊茵衣藻生殖細胞的交配型是在氮脅迫條件下產生(Schauser，1999，2005 ；Borisov，2003)，最終決定萊茵衣藻細胞的交配型 (Ferris, et al. ,1996)。然而，植物中含有RWP-RK保守結構域的基因很多，僅僅通過基因序列的保守結構域并無法知道具體哪一個或一些基因參與了氮素營養和抗旱性。本專利闡述了 osl基因在玉米的氮素代謝以及抗旱脅迫中的功能。
發明內容
玉米是我國的重要糧食作物，當前玉米對氮的利用很低，不但造成肥料份額巨大浪費，而且，化肥的大量濫用給環境造成重要的壓力，由此對我國玉米生產和土壤環境造成巨大損失，同時，干旱也是影響玉米生產的重要因素。通過對控制突變體OSl的基因克隆和功能研究，發現該基因參與了玉米的氮代謝調控途徑，同時該基因突變以后osl具有很強的抗旱能力，因此，該基因參與了干旱脅迫調控途徑以及玉米的干旱環境應答過程，這為培育氮高效和抗旱性玉米提供了條件。序列表中的SEQ ID NO :1為OSl基因的編碼框所編碼的蛋白質能夠調控下游重要干旱脅迫響應基因以及氮素吸收代謝基因的表達；序列表中的SEQ ID NO :2為OSl基因的啟動子可能是干旱和氮信號傳遞重要部位；序列表中的SEQ ID NO 3為編碼框，編碼蛋白質的序列是SEQ ID NO 1序列表中的SEQ ID NO 4為該基因的終止子終止OSl基因的編碼終止；序列表中的SEQ ID NO 5為該基因的全長(DNA水平)。利用本發明的基因編碼的蛋白質序列，可以設計和人工合成密碼子優化的有利于在植物中表達的核苷酸序列。氨基酸序列同源性較高的蛋白質一般具有相同的功能，因此在SEQ IDNo :2所示氨基酸序列具有80%及以上同源性的基因都可能擁有抗旱性及參與植物的氮利用。氨基酸的同源性可以通過http://V驟.ncbi. nhn. nih. rov/中blastP獲得。 通過上述方法獲得的基因屬于本發明的保護范圍。
圖1、突變體和野生型的表型A為Mol7籽粒胚面，B為Mol7籽粒胚乳透明度；C為突變體osl籽粒胚面，D為突變體osl籽粒胚乳透明度圖2、osl基因的精細定位3、osl基因中的第二個外顯子插入轉座子結構圖
圖4、兩個等位基因突變位點5、osl突變體和野生型B73干旱處理10天的抗旱性表現(左圖osl，右圖 B73)。圖6、B73背景下分離群體中的突變體和野生型干旱處理10天的抗旱性表現(左圖突變型，右圖野生型)。圖7、鄭58背景下分離群體中的突變體和野生型干旱處理10天的抗旱性表現(左圖突變型，右圖野生型)。圖8、昌7-2背景下分離群體中的突變體和野生型干旱處理10天的抗旱性表現 (左圖突變型，右圖野生型)。圖9、H99背景下分離群體中的突變體和野生型干旱處理10天的抗旱性表現(左圖突變型，右圖野生型)。圖10 OSl基因的亞細胞定位A-F OSl基因的GFP融合蛋白在洋蔥表皮的定位情況。A-C35S:GFP在GFP光通道(A)、光鏡通道(B)和GFP與光鏡疊加通道(C) ；D-F 35S:GFP:0S1在GFP光通道(D)、光鏡通道(E)和GFP與光鏡疊加通道(F)。
具體實施例方式Uosl突變體表型分析osl突變體表現為胚面變小，只有野生型的1/2-1/3大小， 同時胚乳頂部發白并表現為不透明(圖1)。突變體籽粒的含油量明顯降低，但是籽粒中的營養成分氨基酸的含量、部分金屬、非金屬離子、非蛋白氮等均沒有差異。通過與野生型 Mol7組配的6個世代進行的遺傳規律分析表明，該突變體受單基因隱性控制。2、OSl基因的初定位和精細定位以玉米籽粒胚面的大小和胚乳的透明與否為表型鑒定標準，用親本osl和Mol7組配的回交分離群體(BC)對目標基因進行了精細定位，最終用3345個單株把該基因定位在了玉米第二號染色體短臂上2. 03區大約250kb的區間 (圖 2)。3、目標區域的候選基因分析對目標基因所在的250kb區間進行基因注釋以及候選基因的生物信息學分析，結果表明，該區域有3個候選基因，它們分別是Cyclin-B2， HMG-l/21ike protein, RffP-RK transcriptional factor。測序結果表明RWP_RK transcriptional factor基因的第二個外顯子上面有一個3. 5kb的hAT家族的轉座子插入 (圖3)。最終把該基因作為候選基因。4、新等位基因osl-Mul的篩選通過對3507個突變體家系的田間篩選，發現一個新的等位突變體，籽粒表型和osl表現一樣，該家系的名稱為L17627，并命名該突變體為 osl-Mulο5、osl和osl-Mul基因的功能互補對osl_Mul和osl進行等位性測驗發現， osl-Mul和osl是受同一個基因控制，兩個轉座子的插入位點不同(圖4)。最終通過新等位基因的發掘實現了該基因的功能互補。6、OSl基因的亞細胞定位亞細胞定位表明，OSl基因編碼的蛋白質定位在細胞核中，通過該種方法證明了該基因是一個轉錄因子(圖10)。7、osl突變體受氮的調控玉米的根部是感應培養基中的氮素營養最直接的部位，培養基中的營養元素發生變化以后勢必影響根的生長和發育，通過對不用氮到4mM氮素兩個氮素水平下的突變體和野生型根上部和下部生長變化進行了觀察。根上部突變體和野生型在無氮和有氮的水平下表現差別很大，主要的差異表現在葉片上，無氮表現為褪綠; 和野生型相比，突變體在有氮和無氮情況下都表現為長勢較弱。根部中，突變體和野生型在無氮和有氮的水平下表現不明顯；和野生型相比，突變體在有氮和無氮情況下都表現為根生長較弱。8、osl突變體和野生型的抗旱性分析對突變體osl和野生型B73 (圖5)以及 B73 (圖6)、鄭58 (圖7)、昌7-2 (圖8)、H99 (圖9)等4個不同的遺傳背景組配的回交分離群體BCl中的突變型和野生型的干旱處理，在10天不澆水的情況下，發現突變型的抗旱性比野生型有明顯的提高。實施例1、OSl基因的精細定位根據B73的物理圖譜，把標記umc2193和umcl845定位在B73的物理圖譜上，界定兩個標記的序列，并獲得umcl845和umc2193兩個標記之間已經測序的BAC序列，用這些公布的序列來開發新的標記，然后選擇了 12個BAC來開發SSR標記，根據重復序列兩端的保守序列來設計引物，用這些新合成的標記對osl、Mol7以及它們組配的Fl等3個樣品進行多態性標記的篩選，最終開發了 13對有多態性的分子標記，它們分別為AC2066221、 AC2066222、AC2066225、AC2102034、AC199521MSPI、AC1940411、AC1940412、AC1910252、 AC1975212、AC2021625、umc2215、IDP668、IDP3802。用離目標基因較遠的標記umc213和umcl845繼續從BCl分離群體中的大胚和小胚篩選重組單株，共計篩選了 3345株，umc2193和umcl845兩側標記分別篩選了交換單株個數為54株、19株，共計73株，然后用以上13個新開發的標記對這73個重組單株進行進一步的基因型分析。最后，用新開發的標記對遠離目標基因兩側的交換單株進行基因型分析，同時結合交換單株的表型，結果發現，IDP3802 (P3)、AC2066221 (P4)、AC2066222 (Pl)、 AC2102034(P7)使左側(umc2193)和目標基因之間的交換單株分別減少到38株、11株、11 株和 2 株；AC1975212 (P6)、umc2195 (P2)、AC1910252 (P8)、IDP668 (P5)、AC1940411 (P9)使右側(umcl845)和目標基因之間的交換單株分別減少到15株、14株、14株、12株、10株；兩側的交換單株到標記AC199521MSPI(P10)(圖2)的時候，所有的交換單株的都減少為零，這說明該標記在3345個回交分離群體中表現為和目標基因共分離。根據交換單株遞減規律和三點測驗等方法最終把目標基因鎖定在ACC2102034(P7)和AC1940411 (P9)之間，分別有2 個和10個交換單株。對這個區域進一步分析發現該區域有兩個重疊的BACs :AC210203和 AC199521，兩給BACs的長度分別是155kp和198kb，兩個BACs有大約103kb重疊區域，除去重疊區域，兩個標記的實際物理距離約為250kb(圖2)。實施例2、目標區域的候選基因分析對目標基因所在的250kb區間進行基因注釋以及候選基因的生物信息學分析，結果表明，該區域有3個候選基因，它們分別是Cyclin-B2，HMG-1/2 like protein, RffP-RK transcriptional factor，在玉米中這些基因的功能均沒有過報道。對候選基因進行了親本間的測序分析，結果表明候選基因CyClin-B2，HMG-l/2 like protein在基因組水平上兩個親本間沒有差異，RWP-RK transcriptional factor基因的第二個外顯子上面有一個 hAT家族的轉座子插入，該轉座子長度為3. 5kb (圖3)。通過候選基因的生物信息學分析，最終把 RWP-RK transcriptional factor 作為候選基因。實施例3、新等位基因osl-Mul的篩選通過對3507個突變體家系的田間篩選，發現一個有花藥增多的突變體，該家系的名稱為L17627，并命名為osl-Mul，然后用該突變分別與綜31和B73進行雜交，雜交后再進行自交，在自交后代的籽粒中發現果籽粒性狀有分離，經分析發現，這些分離的突變籽粒表型和osl的籽粒表型表現一樣，遺傳規律分析表明新等位基因osl-Mul和osl —樣，也是單基因隱性遺傳。實施例4、osl和osl-Mul基因的功能互補2009年冬在海南進行新等位基因osl-Mul和osl的等位性測驗，首先是把 osl-Mul和osl的突變籽粒進行單行種植，然后對兩個突變體進行正反雜交和分別自交， 結果發現osl-Mul自交后代中的籽粒全部純合，都表現為osl籽粒的突變類型，在雜交果穗Fl的籽粒的也表現出胚面變小、胚乳不透明的突變表型。測序發現，2個突變體(osl和 osl-Mul)的擴增結果分別比野生型多出大約4. 5kb和1. 5kb左右，發現osl-Mul突變體中的插入片段為Mul轉座子，實際大小為1. 3kb，而該基因的其它位點均和野生型沒有堿基差異。因此可以得出osl-Mul和osl突變發生在同一個基因，兩個轉座子插入到OSl基因第二個外顯子的不同位點(圖4)。實施例5、OSl基因組全長cDNA的獲得根據基因注釋結果(http //www. softberry. com)，注釋軟件為FGENESH-M。通過提取玉米自交系B73的葉片總RNA，然后進行反轉錄，然后對擴增產物進行測序。該基因全長為6278bp (Tss-PolA)，該基因有5個外顯子，長度分別為:60bp, 291bp，190bp, 224bp， 228bp ；有4個內含子，長度分別為:117bp, 161bp，3632bp，114bp，5，UTR(非翻譯區)長度為 1289bp，3，UTR長度為30bp編碼cDNA全長為993bp，編碼331個氨基酸。實施例6、OSl基因的亞細胞定位金粉洗滌稱量15mg金粉并放入滅菌后的1.5ml的印pendorf離心管當中，這樣結果是IOX的量；在超凈臺下，向每個離心管中加入500ul冰凍(-20°c )無水乙醇，震蕩15sec，在超凈臺上收集金粉到離心管管底部，靜止30分鐘，直到金粉全部沉淀；然后轉速3000rpm離心60sec，徹底去除乙醇。再向離心管中加入冰浴的無菌ddH20，用手指輕彈混勻，然后轉速3000rpm離心60sec。重復上述步驟2_3次，最后一次用轉速5000rpm離心 15sec，然后移去上清，再用500ulddH20懸浮。震蕩15sec，然后快速懸浮混勻，邊混邊分裝； 具體的分裝方法是先把10個離心管放好，用25ul的量分裝，重復分裝兩次，第一遍從第一個管開始，第二遍從最后一個管開始，這樣每個離心管含有50ul水，1. 5mg金粉。然后蓋上蓋子于-20°C保存備用。DNA包裹步驟首先把要打槍的愈傷分成小塊，堆積在滲透培養基(N60SM)的中央區域，根據計劃做準備；目的DNA的包裹先把分裝好的金粉(_20°C )(每管1. 5mg并保存在50微升超純水當中)放在冰上，同時把CaCL2濃度為2. 5M(4°C )和亞精胺濃度為 0. 1M(-70°C)也放在冰上融化，其中CaCL2和亞精胺分裝成一次性使用的包裝；用手指輕輕彈裝有金粉的離心管使之懸浮起來，然后加入目的DNA (60-200ng)，迅速用手指輕彈使之混勻然后加入50微升CaCL2并用槍頭輕輕吸吐使之混勻，然后加入20微升亞精胺，靜置30 秒把離心管放在漩渦振蕩器上面震蕩10分鐘(注意使旋渦液體不要上升太高，同時使液體全部懸浮起來)；離心管放到冰上靜置5分鐘(如果震蕩以后有金粉在液體表面漂浮，靜置前再用手指輕彈使金粉沉淀下來)，然后2000rpm離心15秒，然后用吸頭吸掉上清加入預冷 (-200C )的無水乙醇250微升，并用槍頭輕輕(使20微升的槍調到10-13微升)吸吐混勻重復以上步驟3-4次，然后加入無水乙醇120-140微升使之平均分成8份并加到宏載片上面開始基因槍轟擊。受體材料的轟擊用鑷子撕取幼嫩洋蔥表皮，切成2cm2左右的小片，將幼嫩的洋蔥表皮擺放在含有相應載體抗生素的MS培養基中央區域緊密擺放預培養4h。選用650psi的破裂膜，用移液器將包裹后的15μ 1金粉-DNA混合物點在轟擊膜中央，采用 PDS-1000/He (Gene Gun System)型基因槍(Bio-Rad)進行轟擊，轟擊距離6cm，真空度為 281η · Hg。轟擊后的洋蔥表皮細胞暗培養24h后在共聚焦顯微鏡(Confocal NIKON D-Eclipse Cl, TE2000-E)下后觀察 GFP 熒光。GFP熒光的觀察小心的把基因槍轟擊后的洋蔥表皮從MS培養基中取下，背面朝上平鋪在加有水的載玻片上，蓋上蓋玻片，用激光掃瞄共聚焦顯微鏡(Confocal:NIKON D-Eclipse CLTE2000-E)觀察GFP熒光。參數激發光波長488nm，GFP熒光通過505_530nm 的濾光片接收。通過構建OSl蛋白與GFP的融合表達載體，利用洋蔥表皮細胞來觀察OSl 蛋白的亞細胞定位。結果表明對照35S:sGFP分布在細胞質中(圖10A-C) ；35S: sGFP:0Sl 融合表達的綠色熒光蛋白定位在細胞核中(圖10D-F)。實施例7、突變體osl和野生型的氮脅迫處理玉米水培生長培養液為霍格蘭缺氮營養液配方進行玉米上述材料的苗期培養， 營養液以Ca(N(X3)2 · 4H20為氮源。玉米植株培養過程選取大小均勻、籽粒飽滿的玉米種子，先經10%的H202消毒20min。再用去離子水沖洗，于25°C催芽，露白后，在洗凈的濕潤沙床上發芽，一葉一心時，挑選長勢一致的苗去除胚乳后移栽到有營養液的水培槽中培養。 開始用1/2濃度營養液，3天后換成完全營養液，以后每隔兩天更換一次，用電動氣泵連續通氣。培養25天。設0、4兩個梯度，每個樣品設二次重復。玉米的根部是感應培養基中的氮素營養最直接的部位，培養基中的營養元素發生變化以后勢必影響根的生長和發育，通過對不用氮到4mM氮素兩個氮素水平下的突變體和野生型根上部和下部生長變化進行了觀察。根上部突變體和野生型在無氮和有氮的水平下表現差別很大，主要的差異表現在葉片上，無氮表現為褪綠；和野生型相比，突變體在有氮和無氮情況下都表現為長勢較弱。 根部中，突變體和野生型在無氮和有氮的水平下表現不明顯；和野生型相比，突變體在有氮和無氮情況下都表現為根生長較弱。實施例8、突變體osl和野生型的干旱處理在溫室環境條件下，用花盆(30X60mm)盛放同樣重量的營養土和蛭石(1 1混合)，然后在每個花盆中種植同樣數量突變體和野生型籽粒，先按照正常的管理方式管理， 等到幼苗長到3片葉的時候開始停止澆水，進行干旱處理，10天以后觀察突變體和野生型的幼苗干旱反應情況。結果發現，突變體osl比野生型B73有較強的抗旱性能(圖5)； 在不同的遺傳背景組配的回交分離群體BCl中，突變型比野生型也表現出明顯的抗旱性 B73 (圖 6)、鄭 58 (圖 7)、昌 7-2 (圖 8)、H99 (圖 9)。序列表
<210>1<211>331<212>PRT<213> 玉米(Zea mays)<400>1MDAAVSTLTALAIFASTVEHAAYRSVQGYRVVGRKGGGWVRWERWVERQFVLSPSFPRCVEVALPAAAP RILPAGffRSRPVFREGQTVDTWRCIVAFDSVAAVAPSSPPPPVLSPFVNPQLQYLSNLYNDLLMVFRFREEKTVPQLVNS KQPIRCGEQGKTSDLGDASESDSD⑶CQSGKELAPPVQKHTRANRKHIDSITLVDIAQYFHLPIRDASKTLKIGVSILKR KCRQYGIPRWPHRKIKSLDSLIHDLEFVLAREDEDEEEEKQLQKDRLAAAINALTKRKSMLESEKETIQQK PAMDLMAETKLFREDVFKRRYRAKSSVMDMD*<210>2<211>2397<212>DNA<213> 玉米(Zea mays)<400>2CCCACGCCCCTCGGTTCCCGTCGACCCACCTATCCCTTTCCCGCATCAAGCCCCCCGGTGTACCACCCG ACCGCCATCCATTGCGACCTCGGCCACATCCACCCCATGGCGACTCGTCGCGCCACCACCGTACTTCGCCCCGTCGACCG GTTGATACTGACGGTCGACGCTCCTCCGGACGCCTCCCCGGTTCCCTCCTCCATTCGCACCGCCCTCGCCAATCCCCAGT AGCGTCGAGCCATGGTGTAGGAGTACGCAATATGCGGCCCTGATGGCCAACCACACTTAGGACCTGGTGCCACGCTCACC ATGCACCAACGTGGTTACCGACAAGTGGATTTTCTGCCACAAGCAGACCTCAGATGTCTCACTCACTTGCTACAAGGTCT GTTGGGTCCTTCGGGGCTTCACCTAGCGTCCCAGAGTGGACTACGACGAGACCTTCAGCCTTGTCGTCAAGTTCGCCATC GTTTGGACCGTTTTCTCCCTCACCTTCTCCTAGGACTGGGTGGTCCATCAGCTCGATGTCAAGAATTCCTTCCTCCATGG CACTCTGATAGAGACGGTCTACTATAGCTAGCCCACCGGCTTCGTCAACTCAGTTCGTTCGCTTACAGTACGACCTTAAG CAGGCGCCGCATGCCTGGTACAGTCGCTTCGCCTCCTACCTAGCCTCCCTCGACTTTGTCGAGGCCAAGTCGGACACGTC CCTATTCATCTACCGTCGCGGTGATGACACTTTCTACCTCCTGCTCTACGTCGATGACATTGTGCTCACGACATCCACCG CCGACCTTCTA
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權利要求
1.調控玉米氮吸收利用和干旱脅迫基因，命名為OSl，其氨基酸殘基如SEQID N0:1所
2.編碼權利要求1所述的OSl基因的啟動子，該基因的啟動子堿基序列如SEQID NO 2所示。
3.編碼權利要求2所述的OSl基因的編碼框，該基因的編碼框堿基序列如SEQID NO 3所示。
4.編碼權利要求1所述的OSl基因終止子，該基因的終止子堿基序列如SEQID NO 4 所示。
5.編碼權利要求1所述的OSl基因全長，該基因的全長堿基序列如SEQID N0:5所示。
6.含有權利要求2、3、4所述的OSl基因的表達元件。
7.含有權利要求2、3、4所述的OSl基因的轉基因細胞。
全文摘要
調控玉米氮吸收利用和干旱脅迫基因OS1及應用本發明公開了參與玉米氮素感應、吸收等生物學途徑，同時調節玉米的抗旱性基因OS1及其應用，該發明屬于植物分子生物學和植物遺傳工程學領域。通過調控該基因的表達水平能夠提高玉米和其它農作物氮素吸收效率和抗旱性能。該基因的氨基酸殘基和編碼框如SEQ ID NO1、3所示。
文檔編號C12N15/113GK102268439SQ20101019243
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月7日 優先權日2010年6月7日
發明者宋偉彬, 董永彬, 賴錦盛, 趙海銘, 魯曉民 申請人:中國農業大學