促進蘭州百合生長和耐干旱脅迫的2株內生真菌的制作方法
【專利摘要】本發明公開了促進蘭州百合生長和耐干旱脅迫的2株內生真菌。干旱脅迫是阻礙蘭州百合高效生產的重要原因，兩株真菌對于解決蘭州百合干旱脅迫的耐受性問題具有重要意義。它們可以在蘭州百合根部定殖，用于蘭州百合的育苗或栽培中，能夠有效的促進蘭州百合的生長和抵御干旱脅迫。77042013.05.3077032013.05.30
【專利說明】促進蘭州百合生長和耐干旱脅迫的2株內生真菌
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物工程【技術領域】，具體地說涉及2株促進蘭州百合生長和耐干旱脅 迫的內生真菌菌株。這兩株真菌用于蘭州百合的育苗或栽培中，能有效的促進百合生長和 抵御干旱脅迫。
【背景技術】
[0002] 蘭州百合（Lilium davidii var. unicolor)是川百合的變種，在甘肅蘭州及附近 地區栽培已有一百多年歷史。蘭州百合鱗莖肥厚潔白，質地綿軟，甘美香甜，是百合中的珍 品；同時蘭州百合還含有秋水仙堿、百合甙等多種藥用成分以及維生素、礦質元素、氨基酸 等，中醫上具有補中益氣、理脾健胃、寧心安神、潤肺止咳、清熱利尿、解無名腫毒及止血等 功效，并且對肺癌和白血病有一定的抑制作用，藥食兼用，在國內外享有很高的聲譽。蘭州 百合生長在海拔1800-2600m半干旱地區，生長周期長，一般3-5年才可收獲。近些年來，由 于大氣CO 2濃度的持續增加導致全球氣候變暖，而氣溫的升高使土壤含水量降低從而引起 干旱的發生。干旱脅迫對全球農作物產量造成了嚴重損失，在百合種植區，干旱造成百合減 產，品質也嚴重降低，干旱脅迫成為阻礙蘭州百合高效生產的重要原因。
[0003] 水分匱缺是干旱和半干旱地區影響植物生長的最普遍的因素，所以需要提高植 物捕捉和利用水分和養料的效率。利用植物內生真菌接種植物可以促進生長在干旱和 半干旱地區的植物對干旱脅迫的抗性（Marulanda et al.，2007)。在干旱脅迫時，內生 真菌不僅可以通過刺激植物產生避旱（形態改變)，耐旱（生理和生化適應）以及復水恢復 (Malinowski&Belesky, 2000)等機制應對干旱脅迫，而且它們能長期定殖于植物根部，還能 通過改善土壤結構并提高植物礦質營養吸收等方式來促進植物生長。植物內生真菌所具 有的增強植物對脅迫的抗性的能力為減輕全球氣候變化對農業生產和當地的植物群落的 影響提供了一個新的策略。
[0004] 在我們對百合屬植物種質資源挖掘和評價的研究中，我們在蘭州百合及野生百合 屬植物北京百花山山丹的根中觀察到不同內生真菌的存在，并分離出多種內生真菌。利用 共生培養技術建立起蘭州百合-內生真菌共生體系，篩選出兩株促進蘭州百合生長發育和 耐干旱脅迫的優良菌株，在蘭州百合生產中具有良好的應用前景。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供能夠促進蘭州百合生長和抗干旱脅迫的2種內生真菌，為 解決全球氣候變化導致的水分匱缺對蘭州百合生產的影響提供一個新的策略。
[0006] 本發明提供的2株內生真菌經鑒定分別為：LZl :Acremonium nepalense LZ1，保 藏編號為 CGMCC No. 7703 ;BH5 :Helotiales sp. BH5,保藏編號為 CGMCC No. 7704。這兩株真 菌于2013年5月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。保藏單位 地址：北京市朝陽區北辰西路1號院，中國科學院微生物所。2株真菌的保藏和存活證明見 附件。
[0007] 2株真菌的培養特性分別為：
[0008] LZl :在PDA培養基上生長較快，25° C生長12天菌落直徑可達到5cm。菌落平展， 表面白色，部分菌落從中心向邊緣形成扇形的灰黑色區域，邊緣淡粉色，后期整個菌落變成 深褐色。菌絲透明，厚垣孢子間生于菌絲中或頂生于短枝上。瓶梗多直接從菌絲長出，錐形， 光滑，頂端較細，長30?55 μ m ;有時也形成分生孢子梗，多較短，偶爾有分枝。分生孢子頂 生，不成鏈狀，橢圓形，無色，光滑，大部分含有兩個大油滴，3. 5?5. 0 μ mX 2. 0?2. 5 μ m。 基于以上培養特征和顯微形態特征結果，依據《真菌鑒定手冊》和《真菌的形態和分類》，可 知內生真菌LZl與尼泊爾枝頂孢（Acremonium nepalense)最為相似。所測得的18S rDNA 序列在Genebank核酸序列數據庫中進行同源搜索，找出該菌株與數據庫中同源性最高的 模式菌株。結合形態鑒定，確認菌株LZl為尼泊爾枝頂孢（Acremonium nepalense)，將該菌 株命名為尼泊爾枝頂孢LZl。
[0009] BH5 :在PDA培養基上生長極其緩慢，25° C生長21天菌落直徑只有I. 9cm左右。 菌落灰黑色，中心形成突起，邊緣白色，后期整個菌落變成黑褐色。氣生菌絲較發達，絨毛 狀，覆蓋在菌落表面。在常規培養基上不產生孢子。
[0010] 本發明所述的2株內生真菌的內轉錄間隔區核糖體DNA的序列如序列表所示。
[0011] 本發明還涉及所述的2株內生真菌用于促進植物、特別是蘭州百合的生長和/或 抵御干旱脅迫的用途。本發明還涉及在植物、特別是蘭州百合的育苗和/或栽培中使用所 述真菌，用于促進生長和/或抵御干旱脅迫的用途。
[0012] 本發明的顯著優點：本發明的內生真菌可以促進蘭州百合的生長，并且在干旱脅 迫時，2株內生真菌可以增加蘭州百合對干旱的耐受性，促進復水后百合幼苗的快速恢復和 生長，提高干旱脅迫條件下蘭州百合的存活率。內生真菌來自蘭州百合和百合科植物山丹 的根中，對人畜無毒無害，不造成環境污染，有助于解決蘭州百合生產中面臨的水分匱缺問 題，具有重要的經濟意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1 :共培養35d后，LZl接種組與CK對照組的蘭州百合組培苗的生長狀況。
[0014] 圖2 :共培養35d后，BH5接種組與CK對照組的蘭州百合組培苗的生長狀況。
[0015] 圖3 :共培養35d后，基質相對含水量達到40%-50%中度干旱脅迫，LZl接種組與 CK對照組的蘭州百合幼苗狀況。
[0016] 圖4 :共培養35d后，基質相對含水量達到40%-50%中度干旱脅迫，BH5接種組與 CK對照組蘭州百合幼苗狀況。
[0017] 圖5IA :干旱脅迫處理23d后，LZl共培養組和CK對照組的百合幼苗狀況。
[0018] 圖5IB :干旱脅迫處理23d后，BH5共培養組和CK對照組的百合幼苗狀況。
[0019] 圖6IIA :重新澆水12d后，LZl共培養組和CK對照組的百合幼苗恢復狀況。
[0020] 圖6IIB :重新澆水12d后，BH5共培養組和CK對照組的百合幼苗恢復狀況。
【具體實施方式】
[0021] 實施例1
[0022] 內生真菌的分離和純化：
[0023] 將采自蘭州的蘭州百合和北京百花山的山丹鱗莖基根自來水沖洗干凈后用蒸餾 水沖洗，晾干后進行表面消毒：70%酒精處理40s，無菌水沖洗，然后用0. 1 %升汞液處理 7min，無菌水沖洗3-4次。在無菌條件下，取IOOuL最后一次沖洗所產生的無菌水涂布在 PDA培養基上，25° C培養24-72小時，觀察有無菌落產生，依此驗證此消毒方法是否殺死了 供試材料表面的微生物。
[0024] 在無菌狀態下將基生根切成0. 2cm長的根段，置于PDA培養基內，25° C條件下靜 止培養。組織塊中出現菌絲后，挑取菌絲轉接入新PDA培養基中純化培養，反復幾次即得到 內生真菌純化菌株，將其接種于PDA培養基斜面試管中，保存于4° C冰箱中。所得的2株 內生真菌為LZl和BH5,已于2013年5月在中科院微生物所菌種保藏中心保藏。
[0025] 實施例2
[0026] LZl對蘭州百合組培苗的促生長作用
[0027] 玻璃培養皿直徑12cm，內盛80mL MS+20g/L蔗糖+瓊脂7%，每皿接種2棵蘭州百 合組培苗；在PDA培養基上活化的LZl菌株，用0. 5_的打孔器打取菌片，將一個菌片接種 在與苗相距Icm處，對照接一片相同大小的PDA培養基。在晝/夜=25° C/18° C，光照周 期14/10h，照度2000Lx條件下培養。共培養35d后，接種組的蘭州百合組培苗的生長狀況 顯著優于對照組（圖1)，與真菌LZl共培養的幼苗植株高度和幼苗干重分別比對照組增加 了 35. 8%和57. 1%，葉片數目和根分支數分別比對照增加95. 5%和52. 9%。
[0028] 實施例3
[0029] 干旱脅迫條件下LZl對蘭州百合幼苗的促生長作用
[0030] 在250mL三角瓶的基部平鋪一層粉碎至0· 5_lcm大小的楊樹(楊柳科Salicaceae) 樹葉，然后放入50g蛭石，12Γ C滅菌lh。每瓶加入25mL的MS+20g/L蔗糖營養液，無菌狀 態下在樹葉上放置在PDA液體培養基上培養的菌種0. 4mL，蘭州百合組培苗接種在樹葉上， 用蛭石把根埋好，不接菌的對照組接相同體積的PDA液體培養基。每瓶接種2棵幼苗，以帶 透氣孔的封口膜封口，在28° C，照度2000LX條件下連續光照培養。實驗開始基質相對含 水量達到約90%，然后放置在培養室通過基質中水分的散失使其自然干旱，每日上午9:00 時稱重，計算基質實際相對含水量。共培養35d后，基質相對含水量達到40%-50%中度干旱 脅迫，對照組蘭州百合幼苗葉片全部枯萎，而LZl接種組僅有部分葉片枯萎（圖3A，B)。LZl 接種組百合幼苗小鱗莖是對照的1. 875倍，幼苗干重比對照增加140%。共培養35d后，將 LZl接種組及對照組百合幼苗移栽入盛有栽培基質(草炭土 ：蛭石=3:1)的花盆中，正常澆 水誘導12d之后，斷水進行模擬干旱處理，模擬干旱處理23d后重新澆水，記錄與LZl共培 養組和對照組幼苗對干旱脅迫的反應。結果顯示：干旱脅迫處理23d后，LZl共培養組和對 照組百合幼苗都顯示嚴重的萎蔫癥狀，且對照組部分幼苗地上部分枯萎（圖5IA)。但是重 新澆水12d后，LZl共培養組百合幼苗能快速恢復，并且存活率為100%，而對照組恢復緩慢， 并且恢復率只有70-80%(圖6IIA)。表明LZl能顯著提高干旱脅迫后百合幼苗的生長和恢 復能力。
[0031] 實施例4
[0032] BH5對蘭州百合組培苗的促生長作用
[0033] 玻璃培養皿直徑12cm，內盛80mL MS+20g/L蔗糖+瓊脂7%，每皿接種2棵蘭州百 合組培苗；在PDA培養基上活化的BH5菌株，用0. 8mm的打孔器打取菌片，將一個菌片接種 在與苗相距2cm處，對照接一片相同大小的PDA培養基。在晝/夜=25° C/18° C，光照周 期14/10h，照度2000Lx條件下培養。共培養35d后，接種組的蘭州百合組培苗的生長狀況 顯著優于對照組（圖2)，與真菌BH5共培養的幼苗干重比對照組增加了 25. 1%，葉片數目和 根分支數分別比對照增加37. 9%和33. 3%。
[0034] 實施例5
[0035] 干旱脅迫條件下BH5對蘭州百合幼苗的促生長作用
[0036] 在250mL三角瓶的基部平鋪一層粉碎至0· 5_lcm大小的楊樹(楊柳科Salicaceae) 樹葉，然后放入50g蛭石，12Γ C滅菌lh。每瓶加入25mL的MS+20g/L蔗糖營養液，無菌 狀態下在樹葉上放置在PDA液體培養基上培養的BH5菌種0. 4mL，蘭州百合組培苗接種在 樹葉上，用蛭石把根埋好，不接菌的對照組接相同體積的PDA液體培養基。每瓶接種2棵幼 苗，以帶透氣孔的封口膜封口，在28° C，照度2000Lx條件下連續光照培養。實驗開始基質 相對含水量達到約90%，然后放置在培養室通過基質中水分的散失使其自然干旱，每日上午 9:00時稱重，計算基質實際相對含水量.共培養35d后，基質相對含水量達到40%-50%中度 干旱脅迫，對照組蘭州百合幼苗葉片全部枯萎，而BH5接種組僅有部分葉片枯萎（圖4A，B)。 BH5接種組百合幼苗小鱗莖是對照的1. 625倍，幼苗干重比對照增加60%。共培養35d后， 將BH5接種組及對照組百合幼苗移栽入盛有栽培基質(草炭土 ：蛭石=3:1)的花盆中，正 常澆水誘導12d之后，斷水進行模擬干旱處理，模擬干旱處理23d后重新澆水，記錄與BH5 共培養組和對照組幼苗對干旱脅迫的反應。結果顯示：干旱脅迫處理23d后，BH5共培養組 和對照組百合幼苗都顯示嚴重的萎蔫癥狀（圖5IB)，且對照組部分幼苗地上部分枯萎。但 是重新澆水12d后，BH5共培養組百合幼苗能快速恢復，并且存活率為100%，而對照組恢復 率只有70-80%(圖6IIB)。表明BH5能顯著提高干旱脅迫后百合幼苗的生長和恢復能力。
【權利要求】
1-保藏編號為[61\〇^1^0.7703 的尼泊爾枝頂抱（4(^61]1011；[11111116。3161186 81：四；[111^1) 或保藏編號為CGMCC No. 7704的柔膜菌目真菌（Helotiales sp. BH5)。
2. 根據權利要求1所述的真菌用于促進植物生長和/或抵御干旱脅迫的用途。
3. 根據權利要求2所述的用途，其中在植物的育苗和/或栽培中使用所述真菌。
4. 根據權利要求2或3所述的用途，其中所述植物是蘭州百合。
【文檔編號】C12N1/14GK104277979SQ201310284777
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月8日 優先權日:2013年7月8日
【發明者】武利勤, 尚宏忠, 白錦榮, 顧海科, 王青, 劉桂君 申請人:北京市輻射中心