專利名稱：一種水稻干旱脅迫應答蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種可以準確應答水稻干旱脅迫的蛋白 及其編碼基因，以及這種基因的調控元件在水稻抗旱中的應用。
背景技術：
植物的生長發育需要水分，礦物質和有機物質的供應，同時也受到植物生長物質 的調節與控制。人類種植作物已有上萬年的歷史，如何增強作物抗災害能力、提高產量一直 是種植業一大難題。其中干旱是危害面積最廣，危害程度最大的災害之一。當植物遭遇干 旱逆境時，植物體迅速感知外部信號，并迅速傳導到細胞內部，進而激活許多干旱脅迫應答 基因的表達，在植物體內產生大量的特異性蛋白，協同調節植物生理生化一級代謝的變化， 從而提高對干旱的耐性。與其他旱作植物相比，水稻對水分脅迫更為敏感，水分虧缺會使植 株發育受阻，分蘗減少，花粉敗育，產量減少等。植物生理學家和育種專家對水稻的長期種 植實踐和觀察發現，生殖發育時期有幾個階段對外界逆境非常敏感，此時遭受脅迫可能會 導致產量的大幅度下降，比如說水稻的第一苞分化至穎花原基分化始期(決定花的個數)， 減數分裂期(決定雌雄育性)，灌漿期(決定種子飽滿程度，千粒重)。這些時期遭受干旱脅迫 會使得花的個數減少、穎花退化、空癟等(楊弘遠編著.水稻生殖生物學.2005，浙江大學 出版社)。水稻全基因測序工作的完成，為針對水稻組織應用高通量的全基因組表達技術 如基因芯片、蛋白質組分析提供了方便。這些高通量的功能基因組研究技術結合公共數 據庫中的序列信息，將有利于克隆水分虧缺條件下的響應基因，進而有望從中發現新的 抗旱基因，分析這些基因上游的啟動子，還能發現可應用于抗旱基因工程育種上的新的 調控元件。通過干旱環境下的轉錄譜分析，我們獲得了一個干旱脅迫后誘導表達的基因 0s07g0422100。0s07g0422100 具有的 PM-19 (19-kDa Plasma Membrane Polyp印tide)結 構域，是最重要的ABA (脫落酸，abscisic acid)誘導結構域之一。植物在遭受干旱脅迫 時，ABA被普遍認為是一種干旱信號而傳遞干旱信息，進而調控體內基因的表達以抵御干 旱造成的傷害。對基因洲進一步分析后發現洲基因的啟動子屬于誘導型 啟動子，特異性地在植物體受到干旱脅迫時啟動該基因的表達，以抵御干旱逆境。根據這一 特性，我們在該啟動子3’端連接一個報告基因(^Λ5)，在植物受到干旱逆境脅迫時，報告基 因便開始表達，經過一種便捷有效的染色方法就可以準確估量植物受災程度，以便及時補 救，有效減少甚至避免損失。0s07g0422100蛋白及其編碼基因的特性讓我們對此基因在研究抗旱功能方面有 很高的期望，對深入研究植物抗旱機制及功能有重大意義。0s07g0422100的調控元件啟動 子驅動報告基因的方法更是提供了一種檢測植物遭受干旱脅迫程度的手段，具有較高的實 際應用價值，應用前景廣闊。
發明內容
本發明的目的是提供一個來源于水稻的可應答干旱的基因及改造該基因后的可 以報告干旱程度的基因。本發明所提供的可應答干旱的蛋白，名稱為0s07g0422100，來源于水稻(ftr^a sativa ssp. japonica)；是下述氨基酸殘基序列之一
1)序列表中的SEQID No:l;
2)將序列表中的SEQID No: 1的氨基酸殘基序列經過一至二十個氨基酸殘基的取代和 /或缺失和/或添加且對植物的生長發育具有調控作用的蛋白質。序列表中的SEQ ID No: 1由173個氨基酸殘基組成。編碼本發明的0s07g0422100基因，是下述核苷酸序列之一
1)序列表中的SEQID No:2的核苷酸序列；
2)編碼序列表中的SEQID No: 1蛋白質序列的DNA ；
3)與序列表中的SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功 能蛋白質的核苷酸序列；
4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQID No: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件用0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液，在65° C下雜交
并洗膜。序列表中的SEQ ID No:2由522個堿基組成，其編碼框為自5’端第1-522位堿基， 編碼具有序列表中的SEQ ID No: 1的氨基酸殘基序列的蛋白質。本發明所提供的可應答干旱的基因0s07g0422100的調控元件為該基因的啟動子 區域，是是下述核苷酸序列之一
1)序列表中的SEQID No:3的核苷酸序列；
2)與序列表中的SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序
列；
3)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQID No: 3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件用0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液，在65° C下雜交
并洗膜。含有本發明基因的重組表達載體、轉基因細胞系和工程菌以及擴增該基因中任一 片段的引物對均屬于本發明的保護范圍。本發明的另一個目的是提供上述基因的應用，包括提供一種用上述基因檢測植物 遭受干旱脅迫程度的方法。在實際應用中，將0s07g0422100的啟動子與報告基因(卵·5)融合，將該構建
轉化水稻，得到可以比較準確地估量植物受到干旱脅迫程度的植株。上述重組表達載體均可按照常規方法構建。本發明的0s07g0422W0是一個抗旱基因，可以在水稻受到干旱脅迫時大量表達， 以抵御干旱逆境。而^^7^ 州的轉基因植株可以報告水稻干旱程度。本發明不 但提供了一種抗旱基因，更提供了一種檢測植物遭受干旱脅迫程度的方法，同時也對深入 研究植物抗旱機制及功能有重大意義。本發明的蛋白質及其編碼基因具有較高的實際應用 價值，應用前景廣闊。
圖1為水稻幼苗(seedling)、未進行干旱處理的水稻花序(flower)和進行干旱處 理后的水稻花序(drought flower)中洲的表達水平。圖2為卵S轉化水稻植株與野生型水稻經過干旱處 理后花苞中的gus染色結果。
具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。所用引物由英駿生物技術有 限公司完成，測序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。實施例1.水稻抗旱基因0s07g0422100的篩選。在水稻二級枝梗形成時，停止灌溉，監測土壤含水量，使之保持在20-30%，持續一 周。取水稻花苞為材料,提取總RNA (Promega, SV total RNA isolation system)，通過基 因芯片比較分析對照植物與被脅迫植物的基因表達譜，初步篩選到包括0s07g0422100的 一些候選基因。以水稻的總RNA為模板，用AMV反轉錄酶(TaKaRa)合成cDNA (依據Plant RT - PCR Kit 2. 01 (TaKaRa)的用戶手冊進行)，用熒光定量PCR試劑盒STOR Premix Ex Taq (TaKaRa)檢測對照植物與被脅迫植物中0s07g0422100的表達情況(依據TaKaRa的用 戶手冊進行)。所用5’和3’引物分別為
5’-TGTGACAGTGTGACTGTGAGGC-3’ ( SEQ ID No:4)； 5，-CAAACCCAACACACAACGCTA-3， ( SEQ ID No:5)。反應按照下列程序進行預變性95°C 3分鐘，1個循環；變性95°C 10秒，退火與 延伸60°C 30秒，40個循環。對比該基因的在幼苗時期(seedling)、未受干旱脅迫的花期 (flower)和受到干旱脅迫的花期(drought flower)的表達量，我們發現0s07g0422100的 表達具有非常高的專一性，僅在受到干旱脅迫后的水稻花穗中特異表達(圖1)。實施例2.洲啟動子的克隆。提取水稻總DNA，以水稻總DNA為模板，PCR擴增0s07g0422100的啟動子部分。5， 和3’引物序列分別為
5’ -AAGTAAACCGTTTTTTAAGGAT-3，( SEQ ID No:6)； 5， -TGAGCTATCAGGGTAGCAGCC-3， (SEQ ID No:7)。50ul PCR反應體系包含模板2ul，高保真酶KOD plus (Τ0Υ0Β0) lul，10X緩沖 液5ul，2.5uM dNTP 8ul，20uM的5'和3，引物各lul，水32ul。反應條件為94° C預變 性2分鐘；94° C變性30秒，55° C退火1分鐘，68° C延伸2分鐘，共30個循環。反應結 束后，將PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化約21Λρ的擴增片段。PCR產物 1^HindYW和勒“/II位點克隆到大腸桿菌表達載體PCAMBIA1301中，測序驗證其正確后得 到大腸桿菌表達質粒 \)CkmikUQ\-0s07g0422100p-gus。實施例3.重組質粒卵S轉化水稻植株。將重組質粒卵S轉化到水稻中。參照Hiei等(Plant Mol Biol, 1997，35 :205 — 218)的方法轉化水稻。將質粒？041^認1301- ^7冰^^70你-卵>5 通過電激法轉入根瘤農桿菌EH105中，經篩選獲得陽性克隆。將攜帶質粒pCAMBIA1301 -0s07g0422100p-gus 的農桿菌EH105 接種到 5ml 含 100mg/L卡那霉素的 YEB 液 體培養基中搖菌培養至對數生長期晚期，再1 :100擴大培養到0D600為0. 5左右。收 集農桿菌菌體并重懸于轉染培養基中。按照常規方法浸染水稻日本晴的愈傷組織，經共培 養感染、抗性培養基篩選及分化培養基上分化得到潮霉素抗性的陽性苗。待小苗長至IOcm 左右時，將小苗移至室外網室種植，收種即得Tl代種子。實施例4. pCAMB IA1301 -0s07g0422100p-gus轉基因水稻植株報告干旱脅迫效果 的檢測。將得到的轉基因水稻Tl代種子正常種植，在水稻二級枝梗形成時，停止灌溉，監 測土壤含水量，使之保持在20-30%，持續一周。取下花序浸于gus染液中，于37°C放置Mh， 70%乙醇浸泡24h以洗脫雜色，觀察經過干旱處理與對照組的花器染色程度。圖2即為轉基 因水稻植株和野生型水稻花序的gus染色結果。未受干旱處理的轉基因水稻植株，其花序 里報告基因gus的表達水平非常之低，而受過干旱處理的轉基因水稻植株，其報告基因卻 呈現了高度表達，因而證明了 0s07g0422100的啟動子為一種干旱誘導型的啟動子，在植物 受到干旱脅迫后在花器官中誘導表達。同時我們的結果還提供了 一種檢測植株水分缺虧的 方法，即通過便捷有效的染色就可以較為地準確估量植物水分缺失的程度，以便及時補救， 有效減少甚至避免損失。
權利要求
1.一種水稻干旱脅迫應答蛋白，其特征在于是下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(1)SEQ ID No 1 ；(2)SEQ ID No: 1的氨基酸殘基序列經過一至二十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加且對植物的生長發育具有調控作用的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述的水稻干旱脅迫應答蛋白的基因，其特征在于為下述核苷酸序 列之一(1)SEQ ID No 2 ；(2)編碼SEQID No: 1蛋白質序列的DNA ；(3)與SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的 核苷酸序列；(4)在高嚴謹條件下與SEQID No:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
3.如權利要求2所述水稻干旱脅迫應答蛋白的基因的調控元件即該基因的啟動子，其 特征在于為下述核苷酸序列之一(1)SEQ ID No 3 ；(2)與SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；(3)在高嚴謹條件下可與SEQID No:3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權利要求2或3所述的水稻干旱脅迫應答基因及其調控元件的表達載體。
5.含有權利要求2或3所述的水稻干旱脅迫應答基因及其調控元件的轉基因細胞系。
6.含有權利要求2或3所述的水稻干旱脅迫應答基因及其調控元件的工程菌。
7.擴增權利要求2或3所述的水稻干旱脅迫應答基因及其調控元件中任一片段的引物對。
8.權利要求2或3所述的水稻干旱脅迫應答基因及其調控元件在植物生長發育中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，所述的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于將所述水稻干旱脅迫應答基因的調控元 件啟動子區域與報告基因^^融合后轉化水稻，在受過干旱處理的轉基因水稻植株里，其 報告基因呈現誘導表達。
全文摘要
本發明屬于生物工程技術領域，具體為一種水稻干旱脅迫應答蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白是下述氨基酸殘基序列之一(1)如SEQ ID No1所示；(2)將SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列經過一至二十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對植物的生長發育具有調控作用的蛋白質。本發明提供一個水稻抗旱基因及建立于此基因調控元件基礎上的有效檢測植物所受干旱脅迫程度的方法。經檢測，該方法具有快速、準確估量水稻植株所受干旱影響程度的特點。本發明為植物缺水檢測提供了一種快速、便捷、有效的方法，并為植物抗旱研究及干旱育種提供了一個優質基因，具有較高的實際應用價值。
文檔編號C12N1/19GK102146131SQ20111011809
公開日2011年8月10日 申請日期2011年5月9日 優先權日2011年5月9日
發明者俞瑜, 牟晨, 董愛武, 金菁, 隋鵬飛 申請人:復旦大學