作 物雜志2010,6:1-9"，公眾可從中國農業大學獲得，僅限用于重復本發明相關實驗。
[0073] 非轉基因玉米鄭58 :記載于"李鳳海等，不同熟期玉米雜交種及其親本子粒脫水 速率的比較研究，玉米科學2012, 20 (6) :17~20" -文，公眾可從中國農業大學獲得，僅限 用于重復本發明相關實驗。
[0074] 實施例1、轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的側翼序列的克隆 陽0巧]一、轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的BAC文庫構建
[0076] 樣品：轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2。
[0077] BAC載體：Epicentre公司生產的plndigoBA巧。
[0078] 大腸桿菌感受態Jnvitrogen公司的DH10B。
[0079] 1、大片段DNA的制備
[0080] 取50g轉基因玉米CC-2白化苗葉片樣品，用液氮快速研磨成細粉，將粉末加到 500血預冷的抽提緩沖液（含0. 25 %TritonX-100)，緩慢攬拌15min，充分混勻。液態先用 1層醫用紗布，再加2層濾布過濾至燒杯中，將濾液分裝在離屯、管中，在3500r/min、4°C條件 下低速離屯、20min，吸干上清液，在每個離屯、管中加入ImL洗涂緩沖液（抽提緩沖液中加入 0. 25%TritonX-100)，用高溫滅菌的毛筆輕輕刷新沉淀的細胞核，使其充分懸浮，加洗涂緩 沖液至約80血，在3500;r/min、4°C下低速離屯、20min，重新沉淀細胞核。加入約1血抽提 緩沖液，用移液器懸浮沉淀的細胞核。細胞核懸浮液在45°C水浴鍋中平衡5min。接著加入 相同體積預熱的1. 5%低烙點瓊脂糖，充分混勻后，用移液器將其分裝于膠塊模子中，凝固 30min。將凝固好的膠塊放在50°C消化液（1%SLS，1%邸TA，5mg/ml蛋白酶K，抑9.0)中 消化24h，消化好的膠塊清洗后，在4°C冰箱中保存。 陽0川 2、大片段DNA的酶切和二次回收
[00間用限制性內切酶化ndin對步驟1的大片段DNA進行酶切。具體如下：將步驟1消 化好的膠塊用50mLTE(含Immol/LPMS巧溶液清洗3次，每次各比。再用不含PMSF的TE溶 液清洗3次，每次各1h。把洗好的膠塊分成大小相等的8份，分裝在加入1mLIX化ndlll buffer的1. 5血離屯、管中，浸泡化，期間每比換1次11XHindlllbuffer,然后加入4. 0 U化ndlll，37°C條件下酶切反應30min。用脈沖場電泳儀檢測酶切結果，切割分子量大小在 200-400化之間膠塊，將膠塊重新嵌入到新配制的膠中進行第2次脈沖場電泳，切割分子量 約100-200化之間的膠條，將膠條放入透析管中，重新脈沖場電泳。
[0083] 3、連接、轉化體系的建立
[0084] 參考BAC載體說明書，將BAC載體和插入片段（步驟2所得）的摩爾比設為1 :1、 5 :1、10 :1共3個處理進行連接。吸取1μ1的連接產物至20μ1的DH10B電轉化感受態細 胞中，充分混勻，冰上冷卻30min，在電壓1. 8kV，電阻200歐，電容25mF的條件下用Bio-rad genepulserXceII電擊儀進行轉化。轉化后快速吸取1血S0C培養基至電擊杯中，混勻 后移至玻璃管中，在恒溫搖床中225r/min，37°C復蘇培養1h。培養好的菌液涂于LB(含有 12. 5pg/mL氯霉素，20yg/mLIPTG和60g/mLX-gal)固體培養板上，在生化培養箱中37°C 培養20h，用滅菌的牙簽挑選陽性克隆保存在384孔培養板，在80°C超低溫冰箱中保存。
[0085] 二、轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的插入片段陽性BAC的篩選
[0086] 從步驟一中挑取白色克隆，利用Qiagen公司的BAC質粒提取試劑盒提取BAC質粒 DNA，利用Notl酶切DNA，鑒定插入片段的大小，結果表明白色克隆均有DNA片段的插入，插 入片段大小為100化左右，如圖1所示。
[0087] 用滅菌的牙簽挑選白色克隆保存在384孔培養板，利用384孔復制器將384孔板 中克隆復制到LB平板上，并對平板序列進行標記，37°C培育1化后，在平板中加入2ml LB 液體培養基，用涂布器將每個LB平板的384個克隆洗脫到2ml離屯、管中，取300 μ 1提質粒 PCR檢測，具體如下：
[0088] 引物序列：
[0089]CC686F:5'-CCTTACCGTGGAGACCGATGC-3'；
[0090]CC686R:5' -CCGCCATGAGGTCCATGAACT-3'。
[0091] 目的片段大小約為68化P。
[0092]反應體系組成：DNA模板2μ1 ;10μΜCC686F0. 5μ1 ;10μΜCC686R0. 5μ1;Taq 0. 3μ1 ;10Xbuffer2μ1;dNTP1.6μ1，(ΜΗ2〇 補足至 20μ1。
[0093] 反應條件如下：95°C預變性5min;95°C變性45s，59°C退火45s，72°C延伸Imin，32 個循環；72°C延伸10min，4°C保存。
[0094]PCR反應完成之后，取10μ1擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖濃度為1%，使 用的電極緩沖液是含有0. 5 μ g/ml漠化乙錠的1 X ΤΑΕ，在5V/cm電壓下電泳30分鐘。上樣 時取5μ1北京全式金生物技術有限公司產品"化200化lus"作為分子量標準。 陽0巧]通過對280個384孔板篩選，獲得了 2個陽性BAC混池，如圖2泳道77和128所 示（未列出所有280個混池的篩選結果）。
[0096] 進一步對陽性混池的384X2個克隆進行篩選，取2μ1菌液作為模板DNA，對 mCrylAc基因進行檢測，引物和方法見前文。獲得了 1個陽性的BAC克隆，如圖3 (未列出所 有384個混池的篩選結果）。
[0097] Ξ、轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的插入片段陽性BAC亞克隆文庫的構建
[0098] 利用Qiagen BAC質粒提取試劑盒提取步驟二鑒定得到的陽性BAC克隆質粒，通過 超聲破碎儀將BAC克隆打斷，回收1. 5-2化區域的DNA片段，末端補平加A后與T載體連接 轉化大腸桿菌，利用M13引物檢測插入片段，見圖4(未列出所有克隆檢測結果），挑取插入 片段大于1化的的克隆進行測序，共挑取了1000個克隆。
[0099] 四、轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的插入片段全長的拼接
[0100] 利用seqMN軟件對步驟Ξ獲得的1000個陽性克隆測序結果進行拼接，拼接結果 如圖5所示，拼接所得序列為序列表中序列7所示。 陽101] 結果表明：目標基因插入在玉米9號染色體114Mb的位置。轉maroACC基因抗除 草劑玉米CC-2的插入子中有2個maroACC完整表達元件的插入，除此之外還有1個35s polyA片段，插入片段中不含有抗生素抗性基因片段。
[0102] 序列7中包含整合入基因組序列全長8635bp，及插入序列5'端旁側序列1889bp， 插入序列3'端旁側序列529化P，共計1582化P，下面W下從5'至3'來說明15820bp序列 的具體信息，見表1。 陽103]表1插入序列信息介紹陽104]
[0106] 注：對應基因組參考位置比對結果參考B73RefGen_v39,由于玉米B73基因組在不 斷更新，參考位置會有變動。 陽107]五、轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的側翼序列的確定
[0108] 根據步驟四的測序后拼接結果，確定轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的5'端側 翼序列如序列表中序列5所示（對應序列7的第1390-2389位）。其中，序列5的第1-500 位為玉米基因組序列，第501-1000位為來自于外源插入基因maroACC所在載體的序列。
[0109] 根據步驟四的測序后拼接結果，確定轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的3'端 側翼序列如序列表中序列6所示（對應序列7的第10025-11024位）。其中，序列6的第 1-500位為來自于外源插入基因maroACC所在載體的序列，第501-1000位為玉米基因組序 列。
[0110] 實施例2、檢測轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的引物對的設計合成
[0111] 根據實施例1獲得的轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的5'端側翼序列（序列 5)，設計篩選特異性的引物對1 ;根據實施例1獲得的轉maroACC基因抗除草劑玉米CC-2的 3'端側翼序列（序列6)，設計篩選特異性的引物對2。
[0112] 針對5'端側翼序列（序列5)設計的引物對1:
[0113]CC-25'aF:5' -AGGCTTTATCCTGTGCAATGCG-3'（序列 1);
[0114]CC-25'aR:5' -ATTGAGTATCCGTTTCCCTCCTTTT-3'（序列 2)。
[0115] 目的片段大小：292bp。
[0116] 理論上，采用該特異引物對（CC-25'aF/CC-25'曰時對轉maroACC基因抗除草劑玉 米CC-2的基因組DNA進行PCR擴增會得到大小為29化