一個參與桃果實脂肪酸形成的基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物分子生物技術和基因工程領域，涉及一個參與桃果實脂肪酸形成 的基因及其應用。
【背景技術】
[0002] 果實香氣是桃的重要感官品質之一，不僅是直接影響消費者食用前的購買行為， 且協同影響食用時的味覺感受，從而影響對桃果實的綜合評價。來源于脂肪酸途徑的己烯 醛具有青香型的香氣特征，是桃果實的特征香氣之一。研究顯示脂肪酸，尤其是不飽和的亞 麻酸是果實香氣物質生物合成的重要前體物質。通過亞麻酸處理番茄和獼猴桃等果肉組織 可以顯著促進己烯醛等香氣物質的生物合成。同時，在番茄中過量表達脂肪酸去飽和酶基 因 FAD，果實亞麻酸含量顯著增加，香氣物質己烯醛含量亦顯著增加。因此，通過改變植物組 織的亞麻酸等底物供應，能顯著影響香氣物質含量。
[0003] 作為脂肪酸重要組分的亞麻酸亦影響桃果實的低溫適應性，進而對低溫下的貯藏 品質和貨架品質產生影響。在低溫、高鹽和干旱等非生物逆境脅迫下，植物體中亞麻酸的含 量增加，以維持膜的流動性和穩定性，降低逆境對膜結構和功能的損害。不飽和脂肪酸亞麻 酸含量在應對低溫脅迫過程中具有重要作用，因此提高亞麻酸含量有利于減輕植物組織冷 害和凍害等低溫傷害癥狀。
[0004] 同時，桃果實中的亞麻酸可作為人類必須脂肪酸的補充來源。亞麻酸與人類生命 活動息息相關，它是調節血脂的功能因子，其在人體內可代謝生成二十二碳六烯酸（DHA) 和二十碳五烯酸（EPA)。實驗證明，亞麻酸可用于治療和預防心腦血管疾病，并在抗癌、抗氧 化、延緩衰老、免疫調節等方面具有重要的生理作用。富含亞麻酸的植物既可作為食用油以 滿足人體脂肪酸的攝入需求，也可用于生產藥品、保健食品，具有廣闊的開發應用前景。
[0005] 鑒別出參與桃果實亞麻酸生物合成相關的脂肪酸去飽和基因，對于闡明桃果實香 氣品質形成以及低溫抗性具有重要意義，且可用于其他作物基于基因工程技術的脂肪酸組 分及香氣品質改良，對提尚食物中的亞麻酸含量，增加風味品質和提尚低溫等環境適應性， 具有重要應用價值。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一個參與桃果實脂肪酸形成的基因，是一個來源于桃的ω-3 脂肪酸去飽和酶基因 PpFAD3-l，具有SEQ:N0. 1所示的核苷酸序列。
[0007] 本發明的另一個目的是提供所述的PpFAD3_l基因在植物中的遺傳轉化中的用 途。利用基因工程技術將PpFAD3-l_SK重組載體轉化普通煙草，獲得的轉基因煙草植株相 較于野生型植株，亞油酸含量顯著降低而亞麻酸含量顯著增加。通過改變脂肪酸的組分，過 表達桃FAD3-1的轉基因煙草香氣物質組分發生顯著改變，同時顯著提高了轉基因煙草植 株在低溫環境下的存活能力。
[0008] 本發明提供的基因特征功能如下：
[0009] 1.基因表達特征：隨著桃果實成熟，PpFAD3_l表達持續增加，基因表達與果實不 飽和脂肪酸亞麻酸的積累呈正相關關系。
[0010] 2.基因功能特征：（1)在釀酒酵母中表達pYES-PpFAD3-l重組載體，通過飼喂底物 亞油酸（18:2)產生了野生釀酒酵母中不存在的亞麻酸（18:3)，證明PpFAD3-l的編碼蛋白 能將亞油酸轉化為亞麻酸。（2)利用基因工程技術獲得過量表達PpFAD3-l的轉基因煙草 植株，顯著降低了葉片組織的亞油酸含量顯著，同時顯著增加了亞麻酸含量。（3)過量表達 PPFAD3-1的轉基因煙草植株，顯著減少了青香型香氣物質己醛的含量，增加了己烯醛含量； (4)通過PpFAD3-l的過量表達，轉基因煙草植株在低溫下的存活率得到了顯著提高，增加 了煙草植株的抗冷性。
[0011] 本發明提供一個來源于桃果實的基因 PPFAD3-1。通過PCR擴增獲得PPFAD3-1全長 序列。在酵母中進行的體外功能驗證表明，PPFAD3-1可以將亞油酸轉化為亞麻酸（18:3)， 具有ω-3脂肪酸去飽和酶功能。在煙草中過量表達PpFAD3_l，轉基因植株的亞油酸含量顯 著下降而亞麻酸含量則增加，脂肪酸組分發生顯著變化。同時，轉基因煙草的香氣物質組分 和抗冷性也發生了變化。主要表現為轉基因煙草的己醛含量顯著降低，導致了己烯醛和己 醛比例顯著提高；過量表達PPFAD3-1的轉基因植株在低溫下的存活率顯著高于非轉基因 煙草。
【附圖說明】
[0012] 圖1 :桃果實的PpFAD3_l表達增強伴隨有亞麻酸含量的增加。
[0013] 圖2 :真核表達結果顯示PpFAD3-l的編碼蛋白催化亞麻酸合成；其中16:0-棕 櫚酸；16:1-棕櫚油酸；16:2_十六碳二烯酸；17:0-十七烷酸；18:0-硬脂酸；18:1_油酸； 18:2-亞油酸；18:3-亞麻酸。
[0014] 圖3 :過量表達PpFAD3-l顯著改變煙草的脂肪酸組分。
[0015] 圖4 :過量表達PpFAD3-l顯著改變煙草的香氣物質含量。
[0016] 圖5 :過量表達PpFAD3_l的顯著增加煙草植株低溫條件下的存活率。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合具體實施例和附圖對本發明做進一步闡述，但實施例不限制本發明的保 護范圍。
[0018] 實施例1 :PpFAD3-l基因克隆
[0019] ( -）實驗方法
[0020] 以擬南芥中具有ω-3脂肪酸去飽和功能的AtFAD3氨基酸序列為參考序列，應 用blastp算法在桃基因組數據庫Peach Genome VI. 0中，查找桃的同源序列，選取匹配 度最高的序列，設計引物對SEQ:NO. 2和SEQ:NO. 3,以桃cDNA為模板，進行PCR擴增獲得 PpFAD3-l序列SEQ:N0. 1，并進行測序驗證。PCR反應體系為50 μ 1，成分分別為：0. 5 μ I Taq 酶（Roche)，5 μ 1 緩沖液（IOX)，4 μ I dNTP(2.5mM)，上下游引物（10 μΜ，Invitrogen)各 2卩1，4卩1。0熟，32.5卩1明。1?1^〇?反應程序為95。(：反應511^11 ;95。(：反應308,58。(：反 應30s，72°C延伸I. 5min，35個循環；最后72°C延伸7min，4°C保存。
[0021] (二）實驗結果
[0022] 經測序驗證，獲得與桃果實基因組數據庫相匹配的PpFAD3-l序列SEQ:N0. 1。
[0023] 實施例2 :桃果實PpFAD3-l基因表達和亞麻酸含量的檢測
[0024] ( -）實驗方法
[0025] L桃果實材料
[0026] 桃果實商業成熟度采收后置于20°C貯藏3d和6d，果肉組織經液氮凍存后存放 于-80°C冰箱待用。設置了 3個生物學重復，每個重復5個果實。
[0027] 2. RNA提取和cDNA合成
[0028] 利用CTAB法提取桃果實總RNA，用TURBO DNase Kit (Ambion)試劑盒去除基因組 DNA 污染后，取 1.0 yg RNA 按 iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)試劑說明書操作合 成 cDNA。
[0029] 3.實時定量PCR(qPCR)分析基因表達
[0030] 以桃 PpTEF2(SEQ:N0. 14)為內參基因，引物為 SEQ:N0. 15 和 SEQ:N0. 16， PpFAD3-l 引物為 SEQ:N0. 4 和 SEQ:N0. 5。qPCR 反應體系包括 10 μ I Ssofast EvaGreen 5即6^1^出1〇-1^(1)，上下游引物（1(^]\1)各141，2 41。0嫩，6 41!120。反應程序為951€ 反應3!1^11;95°(：反應108,60°(：反應308,45個循環。所用儀器為祀〇-1^(10?乂96實時熒光 定量PCR儀，每次檢測都包括以H 2O作反應模板的陰性對照。
[0031] 4.桃果實脂肪酸含量分析
[0032] 桃果實樣品用液氮研磨后，轉移至50ml離心管中，加入15ml正