一種乙腦/黃熱嵌合病毒及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種嵌合病毒，特別涉及一種乙腦/黃熱嵌合病毒及其制備方法和應 用。
【背景技術】
[0002] 黃熱病是一種由黃熱病毒感染引起的、主要發生在非洲亞撒哈拉地區和南美洲熱 帶地區的蚊媒傳染病，發病率大約為20萬例/年，致死率高達20-50 %，其中90 %發生在 非洲。黃熱病毒感染人后可導致從亞臨床感染到威脅生命的多器官衰竭、黃疸和出血等多 種臨床癥狀，其對于居住在疫區的居民和到疫區的旅行者來說都是一種嚴重的公共健康威 脅。由于目前并沒有針對黃熱病的有效的抗病毒藥物，進行黃熱疫苗接種是預防感染唯一 有效的方式。目前，通常使用的疫苗為黃熱減毒活疫苗（17D株）。
[0003] 黃熱減毒活疫苗（17D株）在全球范圍內使用已有70多年的歷史，免疫一針有 效率可以達到90 % -99 %，但是近年來因黃熱病疫苗接種引起的嗜內臟和嗜神經性的 嚴重不良反應報告逐漸增多，截止2013年，疑似由于黃熱疫苗接種（YF17D株）引起的 嚴重不良反應多達629例，其中已被證實與疫苗接種有關、符合布萊頓協作（Brighton Collaboration)標準的有 131 例，死亡 25 例（Vaccine. 2013Dec 16 ;31 (52) :6201-9·)。該 情況的發生已經引起了國際社會的廣泛關注。因此，研發一種更為安全但保護效果好的黃 熱疫苗是目前市場的一種迫切需求。然而，目前未見毒性YF17D株小且保護效果好的黃熱 疫苗的報道。
[0004] 嵌合病毒是利用一些已知特性的病毒株作為受體，以另一個病毒株作為供體提供 結構蛋白基因替換掉受體株的相應位置的基因構建得到的重組病毒，供體株的結構蛋白基 因包含和中和抗性細胞接觸融合內化作用血凝作用等有關的抗原決定簇，這樣產生的嵌合 病毒的生物特性由兩者共同決定。利用穩定的減毒株作為受體株，嵌合進供體株相應的結 構基因，從理論上推斷，在供體株和受體株的基因僅有簡單疊加而無重組的情況下，制得的 嵌合病毒可以在一定程度上降低毒性，但是同時免疫原性和免疫保護作用也會降低；然而， 大量事實證明，重組后嵌合病毒的特性往往并非兩種病毒基因的簡單疊加，兩種不同來源 基因會發生重組進而導致許多特性的變化，如，導致嵌合病毒的毒性不僅沒有降低，反而大 大強于母體株的毒力。因此，獲得毒性降低且免疫保護作用仍然較好的嵌合病毒非常不容 易，具有極大的偶然性。
[0005] 目前，未見以黃熱病毒作為供體株制備可以預防黃熱病的黃熱嵌合病毒的報道。
【發明內容】
[0006] 為了解決上述問題，本發明提供了一種以乙腦病毒減毒株SA14-14-2為框架的乙 腦/黃熱嵌合病毒。
[0007] 本發明首先提供了一種乙腦/黃熱嵌合病毒的cDNA克隆，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本發明乙腦/黃熱嵌合病毒，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本發明還提供了乙腦/黃熱嵌合病毒在制備預防黃熱病的疫苗中的用途。
[0010] 本發明還提供了預防黃熱病的疫苗，它是以前述的嵌合病毒為活性成分，加上藥 學領域可接受的輔料或者輔助性成分制備而成。
[0011] 本發明還提供了前述疫苗在制備預防黃熱病的藥物中的用途。
[0012] 本發明以含有乙腦病毒減毒株SA14-14-2的特定感染性克隆為框架，將其中的 prM/E基因替換為黃熱病毒YF17D株的prM/E，制備得到了特定序列的乙腦/黃熱嵌合病毒 的cDNA克隆，并進一步轉錄得到了特定RNA序列的乙腦/黃熱嵌合病毒Chimeri-JYF。
[0013] 與母體株黃熱病毒17D株相比，本發明嵌合病毒Chimeri-JYF(核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示）的毒性大大降低，而且免疫保護作用相同。本發明嵌合病毒Chimeri-JYF(核 苷酸序列如SEQ ID N0:2所示）的毒性小，免疫保護作用好，用其制備的疫苗可以有效預防 黃熱病毒感染，而且安全性好，可用于替代目前的黃熱減毒活疫苗（17D株），在保證免疫保 護效果的同時，有效提高臨床使用的安全性，應用前景良好。
[0014] 顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離 本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0015] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容 所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[0016] 圖I pACNR-JEV5'及pACNR-JEV3'半分子構建示意圖
[0017] 圖2乙腦病毒SA14-14-2全長克隆pJFC質粒結構示意圖
[0018] 圖3 pJFC全長質粒酶切鑒定圖譜
[0019] 圖4恢復病毒r JEV的RT-PCR鑒定
[0020] 圖5 JEV恢復病毒細胞病變特征
[0021] 圖6免疫熒光檢測rJEV
[0022] 圖7 JEV恢復病毒與疫苗株蝕斑形態比較
[0023] 圖8乙腦/黃熱嵌合片段5'半分子質粒pJE/YF-5'的構建
[0024] 圖9乙腦/黃熱嵌合全長克隆構建及鑒定
[0025] 圖10 Chimeri-JYF轉染PHK細胞病變特征
[0026] 圖11免疫熒光鑒定恢復病毒Chimeri-JYF
[0027] 圖12 Chimeri-JYF在BHK21細胞上蝕斑形態
[0028] 圖13 Chimeri-JYF在原代地鼠腎細胞的生長曲線
[0029] 圖14 Chimeri-JYF免疫對小鼠免疫保護作用
[0030] 具體實施實例
[0031] 實施例1本發明嵌合病毒的構建
[0032] 一、含JEV疫苗株SA14-14-2全長感染性全長cDNA克隆的構建、鑒定及重組病毒 的恢復
[0033] 1、低拷貝質粒pACNR多克隆位點的改造
[0034] 分別溶解 01 igo-1 (5, -CGCGCCATTAGGCGCCTTATAGATCTAATGTCCGGATTATGGATCCTGA TTGATCATTATTCTAGAATTAC-3'，下劃線處依次為 KasI、Bglll、BspEI、BamHI、Bell、XbaI 識 別位點）和 01ig〇_2(5' -TCGAGTAATTCTAGAATAATGATCAATCAGGATCCATAATCCGGACATTAGATCTA TAAGGCGCCTAATGG-3'，與Oligo-I形成互補雙鏈后，5'和3'端分別形成AscI和Xhol酶切 后粘端，皆由上海英濰捷基生物技術有限公司）于100 μ 1滅菌雙蒸水中，各取10 μ 1混合， 加熱到100°C后自然冷卻，取2 μ 1與用AscI和Xhol雙酶切的pACNR于4°C連接過夜（限 制性內切酶和連接試劑盒皆為美國NEB公司產品），轉化感受態細胞TOPlO (天根生化科技 (北京）有限公司），挑取氨芐青霉素抗性克隆抽提質粒做測序鑒定（上海英濰捷基生物技 術有限公司）。
[0035] 測序結果表明：酶切位點被植入質粒的多克隆區，完成了質粒的多克隆區的位點 改造，為進一步克隆全長cDNA做好準備。
[0036] 2、JEV疫苗株SA14-14-2病毒RNA的抽提
[0037] JEV SA14-14-2疫苗病毒由成都生物制品研究所有限責任公司生產，按說明書溶 解JEV SA14-14-2凍干粉劑，取400 μ 1病毒液用Roche公司生產的RNA抽提試劑盒（High pure viral RNA kit)進行RNA的抽提（按說明書進行），RNA保存于-80°C備用。
[0038] 3、病毒cDNA的逆轉錄
[0039] 將提取的病毒RNA(分別取11 μ 1)分別用兩條引物 RR5 (5' -GACTGCTTCCTGTGATTGCA-3'）和 RR 1 3 (5' -AGATCCTGTGTTCTTCCT CACCACCAGCTACA-3'）逆轉錄病毒 cDNA,所用試劑盒為 Invitrogen 公司 Superscript? III Reverse Transcriptase，引物由上海英濰捷基生物技術有限公司合成，方法參照試劑盒說 明書進行。
[0040] 4、病毒cDNA片段的PCR擴增及測序
[0041] 取2 μ 1病毒cDNA為模板，分別用引物Fl和RU F2和R3、F4和R4、F5和R6、 F7和R8、F9和R10、Fll和Rll配對擴增相應的cDNA片段（表1)，所用DNA聚合酶為 TaKaRa公司的PrimeSTAR，用降落PCR(Touch_down PCR)進行擴增，擴增條件為：98°C2min ; 98 cC lOsec，58. 5 cC - 53. 5 cC 10sec72 cC kb/min，10 循環；98 cC IOsec 53. 5 cC lOsec， 72°C kb/min，20循環；72°C lOmin。擴增的DNA片段用TaKaRa公司的DNA聚合酶LA進行加 八反應：10父1^1311打6114 1，(1犯1314 1，0嫩7.5 4 1，1^0.5 4 1，721€3〇11^11.反應結束， 直接與TaKaRa公司的T載體pMD19-T進行連接反應。2Xligation buffer 5yl，pMD19-T ΙμL，加 A的PCR產物3μ1，Iigase 1μ1，4Γ連接過夜。連接產物鋪于含有氨芐青霉素、 IPTG和X-gal的LB平板，次日，挑取無色菌落增菌培養，抽提質粒進行酶切和測序鑒定。
[0042] 結果顯示：以cDNA為模板，擴增出了與理論大小相應的7個DNA片段，大小分別為 0· 5kb，2. 2kb，0. 8kb，2. lkb，I. 5kb，2. lkb，I. 8kb。并且，7 個片段都成功克隆到 pMD19-T，測 序結果表明：除了片段1和2人為引入的沉默突變以外，所有片段均無堿基突變、插入和缺 失。
[0043] 表1克隆所用引物
[0044]
[0045] 5、含有JEV 5'半分子（堿基1-3450)質粒和3'半分子（堿基3335-10977)的構 建及酶切鑒定
[0046] 將5'端的3個擴增片段（大小分別為0· 5kb，2. 2kb，0. 8kb)的TA克隆分別用AscI 和KasI、KasI和Bglll、BglII和BspEI雙酶切后，回收目的片段，依次克隆到低拷貝質粒 pACNR中，得到含有JEV 5'半分子質粒pACNR-JEV5'（l-3450nt)。把所擴增的3'端4個 DNA片段（大小分別為2. lkb，I. 5kb，2. lkb，I. 8kb)的TA克隆分別用限制內切酶BspEI和 BamHI、BamHI和Bell、BclI和XbaI、XbaI和XhoI雙酶切后，回收目的片段，依次克隆到低 拷貝質粒pACNR中，得到含有JEV 3'半分子的質粒pACNR-JEV3'（3445-10977nt)。（圖1) 結果表明：3個大小不同的DNA片段被成功克隆到低拷貝質粒中。
[0047] 6、含JEV病毒全長cDNA的構建及鑒定
[0048] 分別用BspEI和XhoI雙酶切質粒pACNR-JEV3'，回收7. 5kb大小的DNA片段，與用 相同酶切的低拷貝質粒PACNR5'連接，篩選鑒定重組子，即為含乙腦病毒SA14-14-2基因組 的全長cDNA克隆質粒，命名為pJFC(1-10977)。（見圖2)。
[0049] 用QIAGEN公司的大提試劑盒（QIAfilter Plasmid Maxi Kit)大量提取質粒，送 上海英濰捷基生物技術有限公司測序，并同時用限制性內切酶對質粒進行酶切鑒定。
[0050] 結果表明：酶切結果與理論相吻合，出現4941，4498, 2000, 1392, 613和138等8條 預期條帶，見圖3 ;測序結果表明：除人為引入的C蛋白基因第378個核苷酸的沉默突變以 外，其余各部分無堿基突變、插入和缺失。
[0051] 7、JEV全長感染性cDNA克隆的體外轉錄、轉染及JEV恢復病毒（rJEV)的獲得及 傳代
[0052] 于37°C用Xhol消化pJFC約3h后，加入綠豆核酸酶于30°C作用30min，加入終 濃度為lg/L的SDS滅活綠豆核酸酶，PCR產物回收試劑盒回收線性化的酶切片段，以回收 片段為模板，用美國Promega公司體外轉錄試劑盒（Promega RiboMAX Large Scale RNA Production Systems_SP6)體外轉錄 RNA,并用 QIAGEN公司 RNA 回收試劑盒（RNAeasy mini kit)回收RNA，電轉染BHK21細胞（電轉染條件為140伏電壓），并轉移至T-25培養瓶于 37°C、5%的C02培養5d，至出現明顯細胞病變，用凍融法收集培養液上清，命名為rJEV。取 第一代（Pl)病毒上清于BHK21細胞做病毒滴度測定。并用上清接種BHK21細胞，收獲上清 的方法進行病毒傳代。
[0053] 結果顯示：轉染BHK21細胞5天，可見細胞出現病變（圖4)。病毒滴度約為 6. 01gPFU/ml，在原代地鼠腎細胞上傳代rJEV恢復病毒滴度可達7. 21gPFU/ml，與疫苗株相 似。
[0054] 8、重組病毒rJEV的RT-PCR鑒定
[0055] 取p3代病毒上清，用羅氏公司高純度病毒RNA抽提試劑盒（High Pure Viral RNA Kit)抽提 rJEV 病毒 RNA,用引物 RR5 (5, -GACTGCTTCCTGTGATTGCA-3'）和 RR13 (5, -AGATCCT GTGTTCTTCCTCACCACCAGCTA CA-3'）逆轉錄病毒cDNA，以此為模板，分別用引物Fl和R3、F4 和R5、F6和R7、F8和R9、FlO和RlO、Fll和Rll配對進行PCR擴增，所得PCR片段純化后 送上海英濰捷基生物技術有限公司進行序列測定。
[0056] 結果表明：PCR片段大小與理論相吻合（大小分別為2. 6kb，2. lkb，I. 8kb，I. 7kb， 1.0 kb，I. 8kb)，見圖5,測序結果表明C蛋白基因第378位堿基含有人為引入的沉默突變 (A - C)，其余各處未發現堿基突變。
[0057] 9、免疫熒光鑒定恢復病毒
[0058] 接種3 X IO4個LLC-MK2細胞到96孔板中，次日，待細胞長成單層，按10 3PFU/孔接 種P3代病毒到孔中，于37°C、5%的C02培養2天，吸去培養液，PBS洗滌1次細胞，加入甲 醇室溫固定20min，棄去甲醇，PBS洗滌3次，加入0. 2% Tritonx-IOO室溫透膜lOmin，PBS 洗滌1次，加入抗JEV E蛋白單克隆抗體（1:10,美國Abeam公司），37°C孵育lh，PBS洗滌 3次，加入FITC標記的羊抗小鼠二抗（1:100,美國Santa Crus公司），37°C孵育lh，PBS洗 滌3次，熒光顯微鏡觀察并拍照，見圖6。
[0059] 10、rJEV在BHK21細胞上的蝕斑形態
[0060] 在六孔板中培養BHK21細胞，待細胞融合度達80% -90%左右，接種p3代重組病 毒和疫苗株，37°C吸附lh，覆蓋物用終濃度為10g/L的低熔點瓊脂糖，于37°C、5% C02培養 5d后用10g/L的結晶紫染色檢測病毒滴度、蝕斑形態和大小。
[0061] 結果表明：rJEV和JEV疫苗株SA14-14-2在BHK21細胞上可以形成大小形態相似 的蝕斑，見圖7。
[0062] 11、rJEV神經毒力的檢測
[0063] 分別用0· 03ml (含病毒3. 51gPFU)和0· 02ml (含病毒3. 31gPFU)病毒液接種4周 齡BALB/c小鼠和3-5天的BALB/c乳鼠各10只，飼養14天，觀察病毒對乳鼠和小鼠的神經 毒力（表2)。結果表明