N0:81(Rc_GI-255582236.9'〇)的殘基187至229、沈9 10^:82。1_61-224059640.9'〇)的殘基150至192、 SEQ ID N0:83(Gm_GI-356548935.pro)的殘基 194 至 236、SEQ ID N0:84(Gm_GI-356544176.9'〇)的殘基194至236、沈9 10側:85(￥￥_61-359487286.9'〇)的殘基194至236、 SEQ ID N0:86(Tc_GI-508704801.pro)的殘基 189 至 231、SEQ ID N0:87(Pp_GI-462414664.pro)的殘基 192至234、沈Q ID NO:88(Cr_GI-482561003.pro)的殘基 190至232、 SEQ ID N0:89(At_GI-22331928.pro)的殘基 195至237或沈Q ID N0:90的殘基 195至237 (S1_GI-460370551 .pro)，如表4中所示。
[0151] 其他適合的EOD結構域序列可使用如本文所述的標準序列分析技術(例如，簡單模 塊構造研究工具(SMART);EMBL化ide化e巧，DE)來鑒別。
[0152] 如本文所述的表達或活性被降低的EODl多膚可包括如表4中所列出的SEQ ID NO 74至90中的任一個的氨基酸序列。在一些優選的實施例中，EODl多膚可包括SEQ ID N0:89 (A巧ODl)或SEQ ID NO: 77或78(OsEODl)的氨基酸序列或可W是此序列的變體，其保留E3泛 素連接酶活性。
[0153] 為SEQ ID N0:74至90中的任一個或其他參考EODl序列的變體的EODl多膚可包括 與所述參考EODl序列具有至少20%、至少30%、至少40 %、至少50%、至少60%、至少70%、 至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %序列同一性的氨基酸序列。
[0154] 為SEQ ID N0:74至90中的任一個的變體的EOD多膚還可包括具有SEQ ID N0:73的 序列的EOD結構域。適合的序列的實例如上所列出。
[0155] 編碼EODl多膚的核酸可包括選自由W下各項組成的組的數據庫條目中列出的核 巧酸序列：XM_002299911. IGI: 224059639 (PtEODl) ;XM_002531864. IGI: 255582235 (RcEODl)；XM_002279758.261:359487285(VvEODl)；XM_003542806.161:356548934 (GmEODla)；XM_003540482.IGI:356544175(GmE0Dlb)；XM_002468372.IGI:242042044 (SbEODl);匪_001147247. IGI :226496788 (ZmEODl);或NP_001030922. IGI :79316205 (AtE0Dl;A口 g63530)，或可W是運些序列中的一個的變體。
[0156] 在一些優選的實施例中，編碼EODl多膚的核酸可包括編碼AtEODl或OsEODl的核巧 酸序列或可W是運些序列中的任一個的變體，所述變體編碼具有EODl活性的多膚。
[0157] 可在任何目標植物物種中使用常規序列分析技術來鑒別表達或活性如本文所述 被降低的EODl多膚和編碼核酸，所述植物物種具體地說作物，如小麥、大麥、玉米、水稻、大 豆；W及另外的農業植物。
[0158] 植物中的DA2突變在本文還顯示協同增強DAl和EODl突變的結合對植物中的產量 相關性狀的作用。
[0159] 本文所述的方法不限于具體的植物物種，并且DA2、DA1和/或EODl的表達或活性可 在任何目標植物物種中降低，如本文所述。
[0160] 目標植物物種中的DAl、DA2或EODl多膚可具有為本文列出的對應DAl、DA2或EODl 參考氨基酸序列的變體的氨基酸序列。為本文列出的參考序列的變體的DAl、DA2或EODl多 膚可包括與所述參考序列具有至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50%、至少60 %、至少 70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列同一性的氨基酸序列。
[0161] 在植物物種中出現的具體氨基酸序列變體可與本文列出的參考序列不同之處在 于1個氨基酸、2、3、4、5-10、10-20、20-30、30-50或多于50個氨基酸的插入、添加、取代或缺 失。
[0162] 目標植物物種中的DAl、DA2或EODl核酸可具有為本文列出的對應DAl、DA2或EODl 參考核巧酸序列的變體的核巧酸序列。例如，變體核巧酸序列可W是本文列出的參考DAl、 DA2或EODl序列的同源物或等位基因，并且可與所述參考DAl、DA2或EODl核巧酸序列的不同 之處在于核酸中的一個或多個(例如2、3、4、5-10、10-20、20-30、30-50或多于50個)核巧酸 的添加、插入、缺失或取代中的一個或多個，從而導致編碼的多膚中一個或多個氨基酸的添 加、插入、缺失或取代。當然，包括對核酸進行的對編碼的氨基酸序列無影響的變化。DA1、 DA2或EODl編碼核酸可包括與參考核酸序列具有至少20%或至少30%序列同一性的序列， 優選至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或 至少98%。序列同一性在上文描述。
[0163] 序列相似性和同一性通常參考算法GAP(Wisconsin Package ,Accelerys , San Diego USA)來定義。GAP使用化edleman和Wunsch算法來比對兩個完整序列，所述算法使匹 配的數目最大化并且使空位的數目最小化。通常，使用缺省參數，其中空位創建罰分=12和 空位延伸罰分=4。使用GAP可能是優選的，但也可使用其他算法，例如化AST(其使用 Altschul 等人（1990) J. Mol. Biol. 215 :405-410 的方法）、FASTA(其使用化 arson 和 Lipman (1988)PNAS USA 85:2444-2448的方法）或Smith-Waterman算法（Smith和Waterman( 1981) J.Mol Biol. 147:195-197)或Altschul等人（1990)同上的TBLASTN程序，通常采用缺省參 數。具體地說，可使用psi-Blast算法(Nucl.Acids Res. (1997)253389-3402)。
[0164] 序列比較可在本文所述的相關序列的全長上進行。
[0165] 適合的變體氨基酸和核巧酸序列可使用標準序列分析技術在任何目標植物物種 中鑒別。
[0166] 為本文列出的參考DAl、DA2或EODl核酸序列的變體的DAl、DA2或EODl核巧酸序列 可在嚴格條件下與所述核酸序列或其互補體選擇性地雜交。
[0167] 嚴格條件包括例如，對于雜交為約80 %-90 %相同的序列，在42 °C下在0.25M Na2HP04(pH7.2)、6.5%SDS、10%硫酸葡聚糖中雜交過夜且在55°C下在0.1XSSC、0.1%SDS 中最終洗涂。對于檢測為大于約90%相同的序列，適合的條件包括在65°C下在0.25M Na抽P04，pH7.2、6.5%SDS、10%硫酸葡聚糖中雜交過夜且在60。C下在0.1XSSC、0.1%SDS 中最終洗涂。
[0168] 在植物核酸制劑情況下可能特別適合的替代方案是5x SSPE(最終0.9M NaCU 0.05M憐酸鋼、0.005M抓TA pH 7.7)、5X登哈特氏溶液、0.5%SDS的溶液，在50°C或65°C下 過夜。根據需要，洗涂可在65°C下在0.2X SSC/0.1%SDS中進行或在50°C-6(rC下在Ix SSC/ 0.1%SDS中進行。
[0169] 如本文所述的核酸可W是全部或部分合成的。尤其的，它們可W是重組的，在于未 在自然中一起發現的核酸序列（不連續延伸）已被連接或W另外的方式人工組合。或者，它 們可能已經被直接合成，例如使用自動合成儀。
[0170] DA2核酸和DAl和/或EODl核酸的表達可通過任何便利的技術在植物的一個或多個 細胞中降低或消除。
[0171] 用于降低植物中的DA2多膚和DAl和/或EODl多膚的表達或活性的方法是本領域中 熟知的并且在下文更詳細地描述。在一些實施例中，活性DA2、DA1和/或EODl多膚的表達可 通過將突變引入植物細胞中的核酸序列中來降低，優選為消除，所述核酸序列編碼所述多 膚或調控所述核酸序列的表達。所述突變可破壞DA2、DA1和/或EODl多膚的表達或功能。適 合的突變包括敲除和敲低突變。在一些實施例中，突變可產生DAl的顯性陰性等位基因。然 后可從所述突變的細胞再生植物。核酸可通過插入或缺失一個或多個核巧酸來突變。用于 突變、滅活或敲除祀基因的技術是本領域中熟知的（參見例如In Vitro Mutagenesis Protocols；Methods in Molecular Biology(第2版化d Jeff Braman；Sambrook J等人 2012.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4片反）CSH Press;Current Protocols in Molecular Biology ;Ed Ausubel等人（2013)Wiley)。在一些實施例中，可通過基因組編 輯技術將突變引入至祀EODl、DA2或DAl基因中，例如RNA引導核酸酶技術如CRISPR、鋒指核 酸酶（ZFN)和轉錄活化因子樣效應物核酸酶（TALEN) (Urno V，F.D.等人Nature reviews .Genetics 11,636-646(2010) ;Joung,J.K.等人Nature reviews .Molecular cell biology 14,49-55(2013) ;Gasiunas，G.等人PNAS USA 109，E2579-2586(2012);Cong，L.等 人Science 339,819-823(2013))。
[0172] 降低表達或活性的序列突變可包括相對于野生型核巧酸序列，一個或多個核巧酸 的缺失、插入或取代，基因擴增或甲基化例如超甲基化的增加或減少。所述一個或多個突變 可W是在核酸序列的編碼或非編碼區中。編碼元件的基因的編碼區中的突變可防止全長活 性蛋白質的翻譯，即截短突變，或允許全長但無活性或受損的功能蛋白質的翻譯，即錯義突 變。編碼元件的基因的非編碼區中，例如調控元件中的突變或表觀遺傳變化如甲基化可防 止所述基因的轉錄。包括一個或多個序列突變的核酸可例如通過調控元件的改變的活性編 碼具有降低的或消除的活性的變體多膚，或可編碼在細胞內具有很少或無表達的野生型多 膚。包括一個或多個序列突變的核酸可相對于未突變的序列具有一個、兩個、=個、四個或 更多個突變。
[0173] 例如，可通過在對應于SEQ ID N0:89的位置44的位置處引入突變如缺失、插入或 取代，例如，A至T取代，來降低、優選為消除EODl的活性。EODl多膚序列中等效于SEQ ID NO: 89的位置44的位置可使用標準序列分析和比對工具來鑒別，如表4中所示。
[0174] 可使用標準序列分析技術，例如通過與本文列出的參考序列比較來在任何目標植 物物種中鑒別DA2、DA1和EODl編碼序列。
[0175] 適用于消除活性DA2、DA1和/或EODl多膚的表達的突變對于技術人員將是顯而易 見的。
[0176] 在一些優選的實施例中，可將降低或消除DA2表達或活性的突變引入至植物細胞 中，所述植物細胞表達顯性陰性的DAl多膚且任選地包括i)編碼EODl抑制子核酸的異源核 酸或i i)降低EODl表達或活性的突變。
[0177] 在一些實施例中，可通過在植物的細胞內表達異源核酸來降低所述植物細胞中的 DAl、DA2和/或EODl多膚的表達，所述異源核酸編碼或轉錄抑制子核酸，例如抑制子RNA或 RNAi分子。抑制子RNA抑制植物細胞中其祀多膚（即DAl、DA2或EOD1)的表達。
[0178] 如本文所述的核酸可W是全部或部分合成的。具體地說，它們可W是重組的，在于 未在自然中一起發現的核酸序列（不連續延伸）已被連接或W另外的方式人工組合。或者， 它們可能已經直接合成，例如使用自動合成儀。
[0179] 核酸當然可W是雙鏈或單鏈的、CDNA或基因組DNA或RNA。取決于設計，核酸可W是 全部或部分合成的。通常，技術人員將了解當核酸包括RNA時，對所示的序列的提及應被解 釋為對RNA等效物的提及，其中U被T取代。
[0180] "異源"指示已使用遺傳工程化或重組方法即通過人干預將所討論的核巧酸的基 因/序列或調控所討論的基因/序列的序列引入至植物或其祖先的所述細胞中。對植物細胞 來說異源的核巧酸序列可W是在所述類型、變種或物種的細胞中非天然存在的（即，外源性 的或外來的）或可W是在所述細胞的所述亞細胞或基因組環境中非天然存在的序列或可W 是在所述細胞中非天然調控的序列，即可操作地連接至非天然調控元件。
[0181] 抑制植物細胞中的祀多膚的表達是本領域中熟知的。適合的抑制子核酸可W是相 對于DAl、DA2和/或EODl基因 W反義或有義取向或兩者插入的祀DAl、DA2和/或EODl基因的 全部或部分的拷貝，W便實現所述祀基因的表達的降低。參見例如，van der Krol等人， (1990)The Plant Cell 2,291-299;化poli等人，（1990)The Plant Cell 2,279-289; Zhang等人，（1992)The Plant Cell 4，1575-1588^及115-4-5,231，020。此方法的其他改進 可在Wogsz^sAees(Biosource)SAngellfcBaulcombe(IggT)Ilie EMBO Journal 16,12:3675-3684; W及Voinnet&Baulcombe( 1997)NaUire389:第553頁中找到。
[0182] 在一些實施例中，抑制子核酸可W是DAl、DA2和/或EODl多膚的表達的有義抑制 子。
[0183] 適合的有義抑制子核酸可W是雙鏈RNA(Fire A.等人化ture，Vol 391,(1998))。 dsRNA介導的沉默是基因特異性的并且經常被稱為RNA干擾(RNAiKRNAi是兩步驟過程。首 先，dsRNA在細胞內裂解W產生具有5'端憐酸醋和3'短突出端（約化t)的約21-2化t長度的 短干擾RNA (S i RNA)。S i RNA祀向對于破壞特異性的相應mRNA序列（Zamor e P . D . Natur e Structural Biology,8,9,746-750,(2001)〇
[0184] siRNA(有時稱為微小RNA)通過結合互補RNA并且觸發mRNA消除(RNAi)或阻止mRNA 翻譯成蛋白質來下調基因表達。SiRNA可通過加工較長雙鏈RNA來獲得，并且當在自然中發 現時通常具有外源性起源。微小-干擾RNA(miRNA)是通過加工短發夾獲得的內源性編碼的 小非編碼RNAdsIRNA和miRNA可抑制攜帶部分互補的祀序列而無 RNA裂解的mRNA的翻譯，并 且降解攜帶完全互補的序列的mRNA。
[01化]因此，本發明提供基于DAl、DA2和/或EODl核酸序列的RNAi序列用于抑制DAl、DA2 和/或EOD1多膚的表達的用途。例如，RNAi序列可對應于本文列出的參考DA2、DAl或EOD1核 巧酸序列的片段或可W是其變體。
[0186] SiRNA分子通常是雙鏈的，并且為了優化RNA介導的祀基因的功能的下調的有效 性，優選的是選擇SiRNA分子的長度和序列W確保由RISC復合物正確識別SiRNA(所述RISC 復合物通過mRNA祀標的SiRNA介導所述識別）并且W使得所述SiRNA短至足W降低宿主應 答。
[0187] miRNA配體通常是單鏈的并且具有使所述配體能夠形成發夾的部分互補的區域。 miRNA是從DNA轉錄的但未翻譯成蛋白質的RNA序列。編碼miRNA的DNA序列比miRNA長。此DNA 序列包括miRNA序列和近似反向互補體。當將此DNA序列轉錄至單鏈RNA分子中時，miRNA序 列及其反向互補體堿基配對W形成部分雙鏈的RNA區段。微小RNA序列的設計在化hn等人， PLoS Biology，11 (2)，1862-1879，2004上討論。
[0188] 通常，意圖模擬SiRNA或miRNA的作用的RNA分子具有10與40個之間的核糖核巧酸 (或其合成類似物），更優選地17與30個之間的核糖核巧酸、更優選19與25個之間的核糖核 巧酸且最優選地21與23個之間的核糖核巧酸。在本發明的采用雙鏈SiRNA的一些實施例中， 所述分子可具有例如一個或兩個(核糖)核巧酸的對稱的3'突出端，通常dTdT 3'突出端的 UU。基于本文提供的公開內容，技術人員可容易地設計適合的SiRNA和miRNA序列，例如使用 資源如SiRNA發現者(Ambion) DSiRNA和miRNA序列可合成產生且外源性地添加 W引起基因 下調或使用表達系統(例如載體)產生。在優選的實施例中，合成性地合成siRNA。
[0189] 較長雙鏈RNA可在細胞中進行加工W產生SiRNA(參見例如Myers(2003)Nature Biotechnology 21:324-328)。較長dsRNA分子可具有例如一個或兩個(核糖)核巧酸的對稱 的3'或5'突出端，或可具有平末端。較長dsRNA分子可W是25個核巧酸或更長。優選地，較長 dsRNA分子的長度是25與30個之間的核巧酸。更優選地，較長dsRNA分子的長度是25與27個 之間的核巧酸。最優選地，較長dsRNA分子的長度是27個核巧酸。可使用載體pDECAP來表達 長度為30個核巧酸或更多的dsRNA(aiinagawa等人，Genes and Dev. ,17,1340-5,2003)。
[0190] 另一個替代方案是在細胞中表達短發夾RNA分子(ShRNA)DShRNA比合成SiRNA更穩 定。ShRNA由通過小環序列分隔的短反向重復序列組成。一個反向重復序列與基因祀標互 補。在細胞中，通過DICER將ShRNA加工成siRNA，所述SiRNA降解祀基因 mRNA且抑制表達。在 優選的實施例中，通過從載體轉錄內源性地(在細胞內）產生shRNA。可通過在RNA聚合酶III 啟動子如人Hl或7SK啟動子或RNA聚合酶II啟動子控制下用編碼ShRNA序列的載體轉染細胞 來在所述細胞內產生shRNA。或者，可通過從載體轉錄外源性地(在體外)合成shRNA。然后可 將ShRNA直接引入至所述細胞中。優選地，ShRNA分子包括DAl、DA2和/或EODl的部分序列。例 如，ShRNA序列的長度在40與100個堿基之間，更優選地長度在40與70個堿基之間。發夾的莖 的長度優選地在19與30個堿基對之間。所述莖可包括G-U配對W使發夾結構穩定。
[0191] 可通過轉錄優選地包括在載體內的核酸序列來重組地制備SiRNA分子、較長dsRNA 分子或miRNA分子。優選地，SiRNA分子、較長dsRNA分子或miRNA分子包括本文列出的參考 DA2、DA1或EODl核巧酸序列或其變體的部分序列。
[0192] 在其他實施例中，抑制子核酸可W是DAl、DA2和/或EODl多膚的表達的反義抑制 子。在使用反義序列來下調基因表達中，將核巧酸序列置于呈"反向取向"的啟動子的控制 下，W使得轉錄產生RNA，所述RNA與從祀基因的"有義"鏈轉錄的正常mRNA互補。參見例如， Rothstein等人，1987; Smith等人，（1988)Nature 3：34,724-726; Zhang等人，（1992)The Plant Cell 4，1575-1588;English等人，（1996)The Plant Cell 8,179-188。反義技術還 綜述于Bourque, (1995)，Plant Science 105,125-149和Flavell(1994)PNAS USA 91， 3490-:3496 中。
[0193] 反義抑制子核酸可包括來自為本文列出的參考DA2、DA1或EODl核巧酸序列或其變 體的片段的核巧酸序列的至少10個核巧酸的反義序列。
[0194] 可能優選的是在用于下調祀序列的表達的序列與所述祀序列中存在完全序列同 一性，但是序列的完全互補性或相似性不是必需的。所使用的序列中的一個或多個核巧酸 可與祀基因不同。因此，根據本發明在基因表達的下調中采用的序列可W是選自可獲得的 那些的野生型序列(例如基因）或運種序列的變體。
[01%]所述序列不必包括開放閱讀框或指定將是可翻譯的RNA。可能優選的是存在對應 反義和有義RNA分子的足夠同源性W雜交。可能存在基因表達的下調，即使在所使用的序列 與祀基因之間存在約5%、10%、15%或20%或更多錯配的情況下。有效地，同源性應足W用 于發生基因表達的下調。
[0196] 抑制子RNA分子可包括編碼DA2、DA1和/或EODl多膚的核酸序列的有義或反義鏈的 10-40個核巧酸。
[0197] 抑制子核酸可W可操作地連接至異源啟動子，例如組織特異性或誘導型啟動子。 例如，珠被和種子特異性啟動子可用于特異性地下調正發育胚珠和種子中的兩種或更多種 DAl、DA2和/或EODl核酸W增加最終種子大小。
[0198] 在一些優選的實施例中，DA2抑制子核酸可在具有編碼顯性陰性的DAl多膚和任選 地EODl抑制子核酸的核酸的植物細胞中表達。
[0199] 編碼抑制子核酸和/或顯性陰性的DAl多膚的核酸可包括在一種或多種載體中。
[0200] 編碼如本文所述的抑制子核酸和/或顯性陰性的DAl多膚的核酸可W可操作地連 接至異源調控序列，如啟動子，例如如上所述的組成型、誘導型、組織特異性或發育特異性 啟動子。
[0201] 編碼如本文所述的抑制子核酸和/或顯性陰性的DAl多膚的核酸可包括在核酸構 建體或載體上。所述構建體或載體優選地適用于轉化至植物細胞中和/或在植物細胞內表 達。載體尤其是呈雙鏈或單鏈線性或環狀形式的任何質粒、粘粒、隧菌體或±壤桿菌屬二元 載體，所述載體可W是或可W不是可自我轉移的或可移動的，并且所述載體可通過整合至 細胞基因組中或染色體外地存在(例如，自主復制具有復制起點的質粒)來轉化原核或真核 宿主，具體地說植物宿主。
[0202] 具體地包括穿梭載體，穿梭載體意指天然地或通過設計能夠在兩種不同的生物體 中復制的DNA媒介物，所述DNA媒介物可選自放線菌屬和相關物種、細菌和真核(例如高等植 物、哺乳動物、酵母或真菌)細胞。
[0203] 如上所述的包括核酸的構建體或載體不必包括啟動子或其他調控序列，特別是如 果所述載體不用于將核酸引入細胞中W用于重組至基因組中。
[0204] 構建體和載體還可包括由賦予可選擇表型（如對抗生素的抗性）的基因組成的可 選擇遺傳標志物，所述抗生素如卡那霉素、潮霉素、草下麟(phospMnotricin)、氯橫隆、甲 氨蝶嶺、慶大霉素、壯觀霉素、咪挫嘟酬類、草甘麟和d-氨基酸。
[0205] 本領域的技術人員能夠例如在微生物或植物細胞中構建載體且設計用于重組基 因表達的方案。可選擇或構建含有適當的調控序列的適合載體，所述調控序列包括啟動子 序列、終止子片段、聚腺巧酸化序列、增強子序列、標記基因 W及適當的其他序列。對于進一 步細節，參見例如，Molecular Cloning: a LaboratoiT Manual:第3版，Sambrook 等人， 2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press和Protocols in Molecular Biology,第二 版，Ausubel等人編輯化hn Wiley&Sons，1992。先前使用的在植物上具有廣泛成功的特定程 序和載體由Bevan,Nucl .Acids Res. (1984) 12,8711-8721) W及Guerineau和MulIineaux, (1993)P1曰nt transformation and expression vectors.In=Plant Molecular Biology Labfax(Croy R畑編輯)0xford,BIOS Scientific Publishers,第1