專利名稱：聚合物及具有所述聚合物的熒光探針的制作方法
技術領域：
上述大量的聚氨基酸已商品化，本領域技術人員可容易購 買和使用合適的聚氨基酸。此外，也可通過連續的肽液相合成法或肽 固相合成法，或N-羧酸酐(NCA)法合成聚氨基酸。
對疏水環境敏感的熒光染料同實施例2-1中一樣對PGA-NR的水溶液(濃度為 lmg/mL)進行熒光測量。其激發波長為550nm，且測量了熒光強度 呈600 - 660nm的最大熒光波長值。如圖3所示，當PAG-NR水溶液 的pH值發生變化時熒光強度發生變化。觀察到熒光強度隨著pH值 的降低而增大。與此相比，在pH值^7時，熒光強度沒有改變。在pH 值為4時的熒光強度相比pH值為7.4時的熒光強度增大了約2.4倍。 因為DEAHB不溶于水，未進行單獨染料的焚光測量。上述結果表明， 有尼羅紅衍生物(其為溶劑化熒光變色染料)被導入到聚谷氨酸的基 團的熒光探針PAG-NR在pH值< 7.4時表現出熒光強度增大。因此， 可將所述探針用于檢測pH值從生理pH值7.4的降低。此外，與 PGA-AN相比，其激發波長和熒光波長位于更長的波長側(^550nm)， 發現這種熒光探針更適用于細胞和活體組織。 實施例2-3
對PGA-AN-Gel在水中的熒光強度的pH依賴性的測量 [0069同實施例2-1中一樣對PGA-AN-Gel的水溶液(濃度為 lmg/mL)進行熒光測量。其激發波長為350nm，且測量了熒光強度 呈440 - 470nm的最大熒光波長值。如圖4所示，當PGA-AN-Gel水 溶液的pH值發生變化時熒光強度發生變化。觀察到熒光強度隨著pH 值的降低而增大。而在pH值為3時的熒光強度相比pH值為7.4時的 熒光強度增大了約1.6倍。
[0070上述結果證明，可將通過納米水凝膠化PGA-AN而得到的熒光探針同未經水凝膠化的熒光探針一樣用作可檢測pH值從生理 pH值7.4降低的熒光探針。 實施例2-4
對PGA-AN1在10%血清中的熒光強度的pH依賴性的測量.
[0071同實施例2-1中一樣對PGA-AN1的磷酸鹽緩沖溶液 (PBS)(探針濃度為lmg/mL)進行熒光測量，所述溶液含有10% 的胎牛血清(FCS )。其激發波長為350nm,且測量了熒光強度呈440 -470nm的最大熒光波長值。如
圖1的黑色圓點所示，當PAG-NR水 溶液的pH值發生變化時熒光強度發生變化。觀察到熒光強度隨著pH 值的降低而增大。與此相比，在pH值^7時，熒光強度沒有改變。在 pH值^4.6時，觀察到探針沉淀。在pH值為5時的熒光強度比pH值 為7時的熒光強度增大了約4倍。作為比較例，圖l中用白色圓點描 繪了對單獨染料(即苯胺基萘磺酸)的熒光強度的pH依賴性。如圖 1所示，未觀察到熒光強度的pH依賴性。上述結果表明，可將有苯 胺基萘基(其為溶劑化熒光變色染料)被導入到聚谷氨酸側鏈上的聚 合物PAG-AN1用作可甚至在10%的血清溶液中維持pH應答性功能 的熒光探針。
實施例2-5
對PGA-AN1的熒光強度對血清濃度的依賴性的評價 [0072通過測量PGA-AN1的熒光強度對血清濃度的依賴性來評 價了 PGA-AN1和血清蛋白的相互作用。將單獨染料(即苯胺基萘磺 酸)用作用于進行比較的低分子探針。此外，還將當環境酸化時焚光 強度以pH依賴性方式升高的LysoSensorTM Blue DND-167( Invitrogen 公司生產；激發波長為373nm，熒光波長為425nm )用作用于進行比 較的低分子pH應答性探針。將各探針溶液加入含0、10。/。和100。/。FCS 的PBS中，然后充分混勻以測量熒光強度。圖5描繪了 FCS濃度與 經無血清PBS溶液中的熒光強度標準化的熒光強度間的關系。使用低 分子探針時，熒光強度隨著血清濃度的增大而增大。此焚光強度的增 大顯然是由所述探針與血清蛋白通過疏水相互作用結合所致。與此相比，PGA-AN1甚至在100%的FCS中都觀察不到顯著的熒光強度變 化，這表明，PGA主鏈抑制染料和血清蛋白的相互作用。上述結果表 明，在本發明的熒光探針中，多肽主鏈有兩個作用pH應答性和抑 制染料-蛋白相互作用。 實施例3-1
本發明的溶劑化熒光變色染料的定義
[0073將共七種熒光染料溶于DMF和PBS中，并測量它們的熒 光強度，其中所述染料為苯胺基萘磺酸鎂(ANS)和苯胺基萘的衍 生物——苯胺基萘亞胺(ANM)，尼羅紅(NR)和尼羅紅衍生物一 —9-二乙氨基-2-羥基-5H-苯并[al吩碌、溱-5-酮(NROH ) ， Cy5、 Cy5.5 和LysoSensorTM Blue DND-167 ( LS )。所有染料均以0.3 - lmM的 DMSO溶液作為原液，并通過用PBS或DMF將其稀釋1000倍而得 到測量樣品。樣品濃度為ANS為3pM， ANM、 NR、 NROH、 Cy5 和LS為lfiM，且Cy5.5為0.6nM。激發坡長ex/焚光坡長emDMF、 emPBS (均以nm表示)如下ANS ( ex350/em468、 em520 ) 、 ANM (ex350/em456 、 em520 ) 、 NR ( ex550/em622 、 em660 ) 、 NROH (ex550/em616、 em659 ) 、 Cy5 ( ex650/em677、 em665 ) 、 Cy5.5 (ex678/em710、 em690 )及LS ( ex373/em439、 em429 )。這些結果 示于圖10。如圖所示，本發明的溶劑化熒光變色染料在DMF中的熒 光強度比在PBS中的熒光強度高20倍以上。
[0074這些實施例證明本發明提供了新型聚合物探針，當所述探 針被置于pH值約為5.5的環境中時比被置于pH值約為7.4的環境中 時具有更高的熒光強度，并且可產生相對高的熒光強度。
[0075這些實施例也證明，可將本發明的聚合物和熒光探針用于 相對精確檢測高度惡性腫瘤位點(即pH值約為5.5的那些位點)。
[0076雖然參照例示實施例描述了本發明，但應了解本發明不僅 限于所公開的例示實施例。需對以下權利要求進行最款范圍的闡釋， 以涵蓋所有可能的修飾，等效結構和功能。
權利要求
1.具有對疏水環境敏感的熒光染料的聚合物，其中當所述聚合物周圍的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4的范圍內時，所述聚合物的二級結構由無規則卷曲變成螺旋結構，且所述對疏水環境敏感的熒光染料周圍的疏水性升高。
2. 具有對疏水環境敏感的熒光染料和聚氨基酸的聚合物，其中當 所述聚氨基酸周圍的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4時，所述 聚合物的二級結構由無規則巻曲變成螺旋結構，且所述對疏水環境敏 感的熒光染料周圍的疏水性升高。
3. 權利要求2的聚合物，其中所述聚氨基酸是聚谷氨酸。
4. 權利要求l的聚合物，其中所述對疏水環境敏感的熒光染料是 溶劑化熒光變色染料。
5. 權利要求4的聚合物，其中所述溶劑化熒光變色染料是苯胺基 萘、尼羅紅、丹磺酰、硝基苯并噁二唑、芘和它們的衍生物中的至少 一種。
6. 用于檢測活體病變位點的焚光探針，其包含權利要求l的聚合物。
7. 權利要求l的聚合物，其中當所述聚合物周圍的pH值降低至 等于或大于5.5并小于6.9時，所述聚合物的二級結構由無規則巻曲變 成螺旋結構。
8. 權利要求2的聚合物，其中當所述聚合物周圍的pH值降低至 等于或大于5.5并小于6.9時，所述聚合物的二級結構由無規則巻曲變 成螺旋結構。
9. 含對疏水環境敏感的熒光染料的聚合物，其中當pH值為7.4 時，所述聚合物的二級結構為無規則巻曲的機率比其為螺旋結構的機 率高；而當pH值為5.5時，所述聚合物的二級結構為螺旋結構的機 率比其為無規則巻曲的機率高。
10. 含聚合物和對疏水環境敏感的熒光染料的熒光探針，其中所述探針在pH值為5,5時的熒光強度高于其在pH值為7.4時的熒光強 度，這是由所述聚合物的二級結構由無規則巻曲變成螺旋結構所致。
11. 權利要求10的熒光探針，其中所述聚合物包括糖鏈、聚氨基 酸和它們的書于生物中的至少一種。
12. 權利要求10的熒光探針，其中所述對疏水環境敏感的熒光染 料周圍的疏水性隨著所述聚合物的二級結構由無規則巻曲變成螺旋結構而升高o
全文摘要
具有對疏水環境敏感的熒光染料的聚合物。當所述聚合物周圍的pH值降低至等于或大于5.5并小于7.4時，所述聚合物的二級結構由無規則卷曲變成螺旋結構。
文檔編號C09B69/10GK101638523SQ20091016501
公開日2010年2月3日 申請日期2009年7月28日 優先權日2008年7月28日
發明者山內文生 申請人:佳能株式會社