專利名稱：艾滋病毒親和吸附柱及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種引起人類免疫缺陷綜合征的艾滋病毒從血液中快速高效去除治療技術，具體涉及一種蛋白親和吸附柱，可特異性清除血液中艾滋病病毒顆粒，并對患者治療后進行定性和定量的檢測。
背景技術：
艾滋病毒
艾滋病毒(AIDS病毒)正式命名為人類免疫缺陷病毒(Human ImmunodeficiencyVirus)屬于反轉錄科(Retroviridae)的慢病毒亞科(Lentiviridae),衣殼為20面體立體對稱，外膜包裹呈球形，直徑約為llOnm，病毒內芯含有兩段相同的核酸鏈和病毒反轉錄酶(DNA聚合酶，核酸酶，整合酶)。核酸類型為單股正鏈RNA，既可作為反轉錄成cDNA的模板，又可作為mRNA直接翻譯蛋白質，基因組大小約為9. 3kb左右。基因組的兩側有長末端重復序列(LTR),3個結構基因(gag、pol、env)和至少6個調控基因(tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、vpx)oHIV的靶細胞主要為Th細胞，⑶4+T細胞是最主要的宿主細胞，簡稱為Τ4淋巴細胞，它是人體免疫系統中最重要的細胞之一。HIV病毒利用外層殼體糖蛋白gpl20附著于Τ4淋巴細胞上的CD4蛋白上，兩者融合后再將自身的一整套遺傳物質RNA注入到T4淋巴細胞內，復制時經反轉錄作用形成RNA-DNA的重組體，然后以雙鏈DNA形式整合到宿主細胞DNA鏈上，細胞酶系在病毒的長末端重復序列(LTR)指導下將整合的HIV DNA轉錄成RNA。其中一部分的RNA分子作為mRNA翻譯出子代病毒的結構和功能蛋白，另一部分成為子代病毒的遺傳物質裝入病毒體中。成熟的子代病毒通過芽生方式從細胞內釋放。新復制的病毒體將感染其他的T4淋巴細胞，并導致人體的T4淋巴細胞數緩慢持續減少，因而其數量會逐漸減少直到機體顯示出艾滋病的征兆。T4淋巴細胞數的缺乏將危及人體免疫系統的安全。當人體每毫升血液中的T4淋巴細胞數減少到20萬以下，一般可被認定為患上了艾滋病，HIV —旦感染將是永久型的。艾滋病艾滋病(AcquiredImmunedeficiency Syndrome, AIDS)又稱獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immunodeficiency syndrome),是由人類免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus, HIV)引起的一種嚴重傳染病。其主要傳播方式為經血、性接觸和母嬰垂直傳播等3種。HIV病毒感染人體后，主要經歷4個階段急性感染期、無癥狀感染期、持續性全身淋巴結腫大綜合征期及艾滋病期。在疾病發展病程中，因為輔助性T淋巴細胞細胞膜上的⑶4分子是艾滋病病毒的主要受體，HIV可侵犯和破壞輔助性T淋巴細胞(⑶4 + T淋巴細胞)，使機體細胞免疫功能受損，可并發各種嚴重的機會性感染和腫瘤，不及時治療最后可導致死亡。
人類免疫缺陷病毒(HIV)感染人體后，一般不會立即發病，大多有一段較長的潛伏期，平均為12年至13年。在長達幾年或十幾年的潛伏期內，可以沒有任何癥狀，而潛伏期的長短，一方面固然與病毒的種類、毒力等因素有關，另一方面還與受感染者的健康狀況、營養情況、精神因素等有關。從感染到發病的漫長過程，在不同階段，與HIV相關的臨床表現也是多種多樣的。艾滋病傳染性較強且目前尚無有效藥物可以根治，對全人類的健康造成了嚴重的威脅。艾滋病的治療據世界衛生組織(WHO)截止到2010年底，全世界現存3，500萬人以上HIV感染者，我國衛生部通報截止2010年10月31日，我國艾滋病病毒感染者和病人370393例，其中病人132440例；死亡68315例。而專家估計艾滋病感染者至少75萬。艾滋病(AIDS)在世界上的蔓延對人類健康和社會經濟發展構成了巨大的威脅，治療和預防艾滋病重要性日益緊迫。AIDS的治療主要包括抗病毒治療、免疫調節治療和機會感染治療等。I.抗病毒治療近年來，使用較多的化學治療藥物主要有核苷類逆轉錄酶抑制劑如齊多夫定(AZT)、地丹諾辛(ddl)、扎西他賓(ddC)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)等；非核苷類逆轉錄酶抑制劑如奈韋那平(Nevirapine)等；蛋白酶抑制劑如沙奎那韋(SquinavJr)、利杜那韋(Ritonavir)等。已有7種核苷類和3種非核苷類逆轉錄酶抑制劑及5種蛋白酶抑制劑共15種抗HIV藥物通過美國食品藥品監督管理局(FDA)批準上市。高效抗逆轉錄病毒療法(HighlyActive antiretroviral Therapy, HAART)又稱“雞尾酒療法”的出現，對于AIDs的治療具有重大意義，可以使艾滋病患者的機會性感染減低，生存期明顯延長。1995年，美籍華人科學家何大一教授首先提出應用兩類藥物中的三種藥聯合治療艾滋病患者，這種治療方法被稱作高效抗逆轉錄病毒療法(Highly Activeantiretroviral Therapy,HAART)。聯合療法具有較強地抗病毒作用，并可避免耐藥株的出現。AZT和3TC聯合治療是抗HIV感染最有效的二聯療法之一，在改善⑶4細胞和降低病毒載量方面優于單一的任何藥物；由二種核苷類逆轉錄酶抑制劑和一種蛋白酶抑制劑組成的三聯療法對降低病毒載量效果十分明顯。但是，由于病毒變異和病毒在細胞內潛伏感染，HAART目前尚不能完全清除HIV-I感染者體內的病毒。在長期治療并且不能清除患者體內的HIV-I的情況下，耐藥毒株的不斷增多和藥物副作用的頻繁出現給當前HIV-I治療帶來了嚴重的挑戰。目前又出現了計劃性間斷療法(SIT)，SIT是希望能在維持患者血液低病毒血癥的同時，減少一段時間的用藥，使病毒載量反彈，再次刺激機體免疫系統，使之恢復對HIV的特異性免疫反應，最后讓免疫系統本身通過特異性和非特異性免疫反應的協同作用來控制體內的HIV。2.免疫調節治療主要藥物有干擾素300萬U，皮下或肌肉注射，每周3次，3-6個月為I個療程；白細胞介素-II250萬U，連續靜脈點滴24小時，每周5次，共4-8周；丙種球蛋白定期使用， 減少細菌感染。另外，一些中藥或其某些成分對免疫功能調節也有積極作用，如中藥甘草中的甘草甜素、靈芝的成分三萜烯、天花粉的提取物天花粉蛋白、丹參、柴胡、黃芩苷及黃芩苷元等等均對艾滋病的治療起積極作用。
3.機會感染的治療在不同地區或國家的艾滋病病人中流行的機會感染種類有所不同，WHO推薦把這兩種比較廉價的預防性治療措施作為對發展中國家HIV感染者的最基本醫療內容。此外，國內外研究較多的兩種預防性治療方法為一是針對母嬰傳播的問題；另一個是針對職業暴露后的預防性治療問題。國外有關艾滋病預防與治療的研究仍在不斷進行用于預防艾滋病毒的疫苗包括HIV基因工程疫苗、HIV核酸疫苗、HIV活載體疫苗等正在研究之中。總體來說，抗病毒治療療效頻繁，毒副作用大，易產生耐藥毒株，成本高；免疫治療法作用不直接，專一性較差，治療效果不明顯，機會治療治療難度大，周期性長，易控難度大。目前仍然缺少一種低副作用、低成本且能夠有效治療艾滋病的手段。
發明內容
本發明的目的在于克服現有艾滋病治療方法存在的缺點和不足，提供一種艾滋病毒免疫親和吸附柱，其能快速簡便地去除艾滋病毒顆粒，達到減緩及治療艾滋病的目的。為實現上述目的，本發明的技術方案為一種艾滋病毒親和吸附柱，包括柱體和位于柱體中的至少一種活化親和微球，所述活化親和微球連接有艾滋病毒親和蛋白，所述親和蛋白能與艾滋病毒結合。其中，所述親和蛋白優選選自⑴主要受體⑶4分子、gpl20抗體、輔助受體CXC趨化因子受體4或CC趨化因子受體5中的一種或多種。上述親和吸附柱，其可以包括以下親和微球中的一種或多種1)連接有主要受體⑶4分子的親和微球；2)連接有gpl20抗體的親和微球；3)連接有輔助受體CXC趨化因子受體4的親和微球；或，5)連接有CC趨化因子受體5的親和微球。本發明的吸附柱可以是包含上述任一種或多種固定一種親和蛋白微球的吸附柱，也可以是包含上述任一種或多種固定多種親和蛋白微球的吸附柱。在實際使用時，可以根據需要搭配不同親和微球。優選在同一微球上固定上述4種親和蛋白。上述親和吸附柱，其在柱體兩端分別具有分離膜，其將親和微球封閉于柱體中。所述分離膜可具有孔徑為10 μ m-100 μ m的過濾孔。上述微球可以是玻璃微球、葡聚糖微球或殼聚糖交聯微球。例如所述親和微球為直徑大于Imm的玻璃微球、直徑大于500 μ m的殼聚糖交聯微球或直徑100-300 μ m的葡聚糖微球。本發明親和吸附柱可以用于分離艾滋病毒，尤其是分離血液中的艾滋病毒。本發明還提供一種制備所述親和吸附柱的方法，其包括如下步驟I)活化，將微球表面活化使其表面分布能連接親和蛋白的基團；2)連接，將親和蛋白連接到微球表面的基團上，使其固定到微球的表面；3)封閉，封閉微球表面未結合的基團，得到活化親和微球；4)裝住，將活化親和微球填裝入吸附柱中；5)封膜，在吸附柱兩端分別用分離膜封閉固定。所述親和蛋白可以通過基因工程手段獲得，其制備方法如下①設計合成引物；
②以Trizol法提取總RNA，RT-PCR得到編碼親和蛋白的cDNA ；③構建cDNA畢赤酵母表達載體；④制備畢赤酵母感受態細胞，并將表達載體轉化該細胞；⑤在畢赤酵母中高密度誘導表達外源基因；⑥SDS-PAGE檢測表達蛋白并測定表達蛋白濃度；⑦分離純化。 本發明具有如下優點本發明免疫親和吸附柱，主要由柱體和吸附劑組成，吸附劑選用親和微球，作為原料，來源豐富，質量穩定，價格便宜，與血液的相容性好。免疫吸附治療法與傳統的艾滋治療方法相比，抗病毒治療療效頻繁，毒副作用大，易產生耐藥毒株，成本高；免疫治療法作用不直接，專一'丨生較差，治療效果不明顯，機會治療治療難度大，周期性長，易控難度大，而該免疫吸附柱創新性地運用各種親和微球作為吸附載體，安全性高，專一性好，吸附量高，毒副作用小，治療時間短，操作簡單。本發明免疫吸附柱利用抗原抗體之間的特異性結合的特點，將人類T細胞表面的⑶4分子這種小分子蛋白、gpl20抗體及輔助受體蛋白CXCR-4和CCR-5固定在載體上，制備成免疫親和吸附微球，裝入帶有分離膜的層析柱內。將HIV感染者的血液通過管道輸入到裝有制備好的免疫親和微球的層析柱內，血液中的HIV病毒顆粒通過其表面抗原與固定在載體上的受體蛋白特異性結合，而將HIV顆粒從血液中吸附掉，最后再將灌流后的不含艾滋病毒的干凈血液重新輸回人體內者體內。經過幾個小時的體外血液循環，HBV患者血液中的HBV顆粒含量降低，最終達到緩減病癥，達到治療艾滋病的目的。
圖I是畢赤酵母整合型分泌表達載體pPic9k的質粒圖譜；圖2是SDS-PAGE檢測⑶4的表達結果；圖3是Western blot檢測0)4的表達結果。
具體實施例方式以下結合實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例I親和蛋白的克隆、表達及純化親和蛋白有⑶4分子、0^-5、0乂0 -4、8 120抗體，均可由真核酵母表達系統表達。以下以主要受體CD4分子為例。人CD4分子是一類相對分子質量約為55kDa的單鏈跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，主要表達于部分T細胞、胸腺細胞、某些B細胞和EB病毒轉化的B細胞、單核-巨噬細胞以及特定區域的腦細胞表面。其在T細胞發育、成熟T細胞的活化以及信號轉導中發揮重要作用，是適應性免疫應答發生的重要效應分子，在維護機體正常生理功能中作用巨大。
人0)4分子cDNA序列長約3100bp,編碼序列長1377bp (GenBank登錄號NM_000616)，編碼區前75bp為信號肽基因序列，終止密碼子后有PolyA加尾信號。
⑶4分子前體由458個氨基酸殘基(AA)組成包括信號肽25個AA，胞膜外區371個AA，跨膜區24個AA以及胞質區38個AA。成熟CD4分子屬于免疫球蛋白超家族，其胞外區由4個免疫球蛋白樣的結構域組成，從N-端到C-端分別命名為D1(1 98)，D2(99 178)，D3 (179 291)和 D4 (292 371)。①引物設計參照GenBank數據庫中的人OMmRNA序列(GenBank登錄號NM_000616),應用軟件Premier5. O分析人⑶4基因序列，根據真核畢赤酵母表達載體Ppic9k的多克隆位點序列，人⑶4起始密碼子ATG前加上2個堿基CG及EcoRI酶切位點GAATTC ;在終止密碼子AUG后加上5個堿基TTCCT及SnaBI酶切位點；設計一對引物如下上游引物為Al 5~CGGAATTCATGAACCGGGGAGTCC-3 (EcoR I)，下游引物為 A2 5~TTCCTTACGTATCAAATGGGGCTACATGTCTT~3(SnaBI)上下游引物理論上的擴增片段大小為約1356bp，以Jurkat細胞株cDNA為模版擴增基因，基因片段經SnaB I和EcoR I雙酶切后定向插入經相同酶切的Ppic9k表達載體中。連接產物轉化ToplOF’大腸桿菌后，對PCR雙酶切篩選陽性的菌株進行測序。②以Trizol法提取總RNA本實驗采用Trizol法提取Jurkat細胞株(ATCC，美國典型培養物保藏中心，保藏號CRL-1990)總的RNA，用反轉錄試劑盒合成第一條鏈，再以其為模板進行PCR擴增，最后用1%瓊脂糖電泳分析PCR產物，以不加模板作為空白對照。Trizol法提取總RNA的具體步驟如下I.提取Jurkat細胞株的細胞RNA時，離心沉淀細胞，每5-10X IO6個細胞加ImlTrizol后，反復用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞；2.將Jurkat細胞株的細胞的Trizol裂解液轉入EP管中，在室溫15_30°C下放置5min ；3.在上述EP管中，按照每Iml Trizol加O. 2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15s，在室溫下(15°C 30°C)放置2 3min后，12000rpm(2°C 8°C )離心15min ；4.取上層水相置于新EP管中，按照每Iml Trizol加O. 5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下(15°C -30°C )放置 lOmin，12000rpm(2°C 8°C )離心 IOmin ；5.棄上清，按照每Iml Trizol加Iml 75 %乙醇進行洗漆，禍旋混合，7500rpm(2°C 8°C )離心 5min,棄上清；6.讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；7.加 DEPC 水溶 RNA 沉淀。RT-PCR 以提取的RNA為模板，逆轉錄生成⑶4的cDNA鏈。RT-PCR 體系為
權利要求
1.一種艾滋病毒親和吸附柱，包括柱體和位于柱體中的至少一種活化親和微球，其特征在于，所述活化親和微球連接有艾滋病毒親和蛋白，所述親和蛋白能與艾滋病毒結合。
2.如權利要求I所述的親和吸附柱，其特征在于，所述親和蛋白選自(I)主要受體CD4分子、gpl20抗體、輔助受體CXC趨化因子受體4或CC趨化因子受體5中的一種或多種。
3.如權利要求I所述的親和吸附柱，其特征在于，其包括以下親和微球中的一種或多 種 1)連接有主要受體⑶4分子的親和微球；2)連接有gpl20抗體的親和微球；3)連接有輔助受體CXC趨化因子受體4的親和微球；或4)連接有CC趨化因子受體5的親和微球。
4.如權利要求Γ3任一項所述的親和吸附柱，其特征在于，所述柱體兩端分別具有分離膜，其將親和微球封閉于柱體中。
5.如權利要求Γ3任一項所述的親和吸附柱，其特征在于，所述分離膜具有孔徑為10-100 Mm的過濾孔。
6.如權利要求Γ3任一項所述的親和吸附柱，其特征在于，所述微球為玻璃微球、葡聚糖微球或殼聚糖交聯微球。
7.如權利要求6所述的親和吸附柱，其特征在于，所述親和微球為直徑大于Imm的玻璃微球、直徑大于500 Mm的殼聚糖交聯微球或直徑100-300 μ m的葡聚糖微球。
8.權利要求Γ6任一項所述的親和吸附柱在分離艾滋病毒中的應用。
9.一種制備權利要求1飛任一項所述親和吸附柱的方法，其包括如下步驟 O活化，將微球表面活化使其表面分布能連接親和蛋白的基團； 2)連接，將親和蛋白連接到微球表面的基團上，使其固定到微球的表面； 3)封閉，封閉微球表面未結合的基團，得到活化親和微球； 4)裝柱，將活化親和微球填裝入吸附柱中； 5)封膜，在吸附柱兩端分別用分離膜封閉固定。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述親和蛋白選自(I)主要受體CD4分子、gpl20抗體、輔助受體CXC趨化因子受體4或CC趨化因子受體5中的一種或多種，其制備方法如下 ①設計合成引物； ②以Trizol法提取總RNA，RT-PCR得到編碼親和蛋白的cDNA； ③構建cDNA畢赤酵母表達載體； ④制備畢赤酵母感受態細胞，并將表達載體轉化該細胞； ⑤在畢赤酵母中高密度誘導表達外源基因； ⑥SDS-PAGE檢測表達蛋白并測定表達蛋白濃度； ⑦分離純化。
全文摘要
本發明公開了一種艾滋病毒親和吸附柱，包括柱體和位于柱體中的至少一種活化親和微球，該活化親和微球連接有艾滋病毒親和蛋白，所述親和蛋白能與艾滋病毒結合。親和蛋白包括主要受體CD4分子、gp120抗體、輔助受體CXC趨化因子受體4(CXCR-4)和CC趨化因子受體5(CCR-5)。親和微球可以為大小1mm的玻璃微球、直徑大于500μm的殼聚糖交聯微球，也可以為葡聚糖微球。本發明適用于清除艾滋病患者血液中的艾滋病毒，減緩、治療艾滋患者的免疫缺陷綜合癥，與傳統的治療方法相比較，該免疫吸附柱安全性高，專一性好，毒副作用小，操作簡單。
文檔編號B01J20/30GK102631891SQ201210118840
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月23日 優先權日2012年4月23日
發明者劉紅蓮, 王業富, 王曼 申請人:武漢大學