一種抗蛋白吸附毛細管電泳共價鍵合涂層柱的制備方法
【專利摘要】本發明提供一種抗蛋白吸附毛細管電泳共價鍵合涂層柱的制備方法。利用聚苯乙烯磺酸鈉和感光聚合物重氮樹脂的靜電自組裝和光固化交聯反應在石英毛細管柱的內壁上構筑共價鍵合抗蛋白吸附涂層。所制備的毛細管電泳涂層柱具有良好的抗蛋白吸附性能，與未涂層的石英毛細管裸柱相比，對蛋白質的分離性能提高1倍以上。本方法所用工藝流程簡單，生產效率高，生產成本低，重復性好，無毒環保，易于大規模生產，制得的共價鍵合毛細管電泳涂層柱具有優良的化學穩定性和抗蛋白吸附性能，適用于對蛋白質、糖蛋白、肽鏈、激素、酶等生物的樣品的電泳分離檢測和純化。
【專利說明】一種抗蛋白吸附毛細管電泳共價鍵合涂層柱的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及抗蛋白吸附毛細管電泳共價鍵合涂層柱的制備方法，確切的說是一種利用聚苯乙烯磺酸鈉和感光聚合物重氮樹脂的靜電自組裝和光固化交聯反應在石英毛細管柱的內壁上構筑共價鍵合抗蛋白吸附涂層的方法。
【背景技術】
[0002]隨著毛細管電泳技術在生命科學研究各領域的發展，對抗蛋白吸附毛細管電泳涂層柱的涂層性能要求也越來越高，理想的涂層應該是既保持了對毛細管壁的修飾作用，抑制蛋白質在管壁的吸附，又不會脫落給聯用設備造成污染。與以物理或離子力吸附在毛細管內壁上的非共價鍵合涂層相比，通過共價鍵合的永久涂層在這方面的優勢在于:共價鍵合的涂層壽命長、穩定性好、分離效率高、不易脫落給質譜儀等聯用設備造成不必要的污染。
[0003]近年來，利用硅烷化試劑作為偶聯劑所制備的抗蛋白吸附共價鍵合涂層柱在毛細管電泳中得到了廣泛的應用。但其缺點在于:制備過程復雜，涉及毛細管硅烷化和引發單體聚合等多步反應；制備中所用硅烷化試劑的毒性很大，對溶劑中的水份十分敏感，易發生水解生成二氧化硅粒子而造成各種涂覆質量問題；毛細管內的聚合反應也很難控制，容易造成涂層的不均一性、不規整性、甚至阻塞毛細管。如:(I) Sun等在《B1chemicalEngineering Journal》雜志2010，53，137-142報道了利用聚乙烯醇(PVA)和硅烷化試劑制備了抗蛋白吸附的毛細管電泳共價鍵合涂層柱。制作過程分為毛細管預處理、硅烷化試劑涂覆、引入含醒基功能分子，聚合物涂層縮醒化等多個步驟；(2)Timperman等在《Analytical Chemistry》雜志2006，78，4326-4333報道了利用含聚乙二醇(PEG)的硅烷化試劑制備了抗蛋白吸附的毛細管芯片電泳共價鍵合涂層柱。制備過程繁瑣、耗時較長，所用的硅烷化試劑具有毒性、易水解、成本昂貴。聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)作為一種非共價鍵合涂層材料在毛細管電泳中也得到了一定的應用，如:(3)Schlenoff等在《AnalyticalChemistry》雜志1999，71，4007-4013報道了利用PSS和甲基二烯丙基氯化銨(PDADMAC)通靜電自組裝的方法在毛細管內壁上制備了非共價鍵合的抗蛋白吸附涂層，但其缺點在于涂層無法通過共價鍵鍵合在毛細管內壁上，壽命短、穩定性差。
[0004]以上所列的毛細管電泳共價鍵合涂層柱的制備方法，普遍工藝流程復雜，操作條件苛刻，生產過程毒性較大，生產效率偏低，生產成本偏高，所制備抗蛋白吸附毛細管電泳共價鍵合涂層柱的質量不穩定，限制了它們在蛋白質分離分析中的應用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種簡化抗蛋白吸附毛細管電泳共價鍵合涂層柱的制備方法，解決制備工藝流程復雜、操作條件苛刻、生產過程毒性大、生產效率低、生產成本高、所制備抗蛋白吸附毛細管電泳共價鍵合涂層柱質量不佳的問題。
[0006]本發明的技術方案是:一種抗蛋白吸附毛細管電泳共價鍵合涂層柱的制備方法，其特征在于利用水溶性的感光重氮樹脂作為一種帶正電的偶聯劑將帶負電的聚苯乙烯磺酸鈉通過靜電相互作用層層自組裝在石英毛細管柱的內壁上，經過紫外光照后重氮樹脂同時與石英毛細管內壁上的硅羥基和聚苯乙烯磺酸鈉的磺酸基發生光固化交聯反應，從而在石英毛細管內壁上形成穩定的重氮樹脂-聚苯乙烯磺酸鈉復合結構共價鍵合涂層。
[0007]本發明所用的重氮樹脂的分子量在400至100000，分子量太低，則自組裝涂覆性能不佳，分子量太高則水溶性不好，優選的分子量為750至5000。
[0008]本發明所用的聚苯乙烯磺酸鈉的分子量在5000至600000，分子量太低，則自組裝涂覆性能不佳，分子量太高則水溶性不好，優選的分子量為10000至100000。
[0009]本發明所用的重氮樹脂和聚苯乙烯磺酸鈉水溶液的濃度均為0.0lmg / ml至100mg / ml，濃度太低，則自組裝涂覆性能不佳，濃度太高則流動性變差，優選的濃度均為
0.1mg / ml 至 10mg / ml。
[0010]本發明所用的重氮樹脂-聚苯乙烯磺酸鈉層層自組裝的溫度在I至50°C，自組裝溫度過低，則水溶液容易結冰，自組裝溫度過高則重氮樹脂容易熱解，優選的自組裝溫度在I 至 35。。。
[0011 ] 本發明所用的重氮樹脂-聚苯乙烯磺酸鈉層層自組裝復合結構涂層的層數在2至12層，層數太少，則抗蛋白吸附性能不佳，層數太多則生產效率降低，優選的層層自組裝復合結構涂層的層數為2至8層。
[0012]本發明所用的紫外曝光光源波長在193nm至400nm,曝光劑量為5mJ / cm2至20000mJ / cm2。曝光光源波長太短或太長，曝光劑量太高或太低，都會導致涂層光固化交聯的質量下降，優選的紫外曝光光源波長在248nm至365nm,曝光劑量為30mJ / cm2至6000mJ / cm2。
[0013]與現有技術相比，本發明的優點在于:
[0014](I)采用本發明的方法，無須使用高毒性、價格昂貴的硅烷化試劑作為偶聯劑，簡化了毛細管電泳共價鍵合涂層柱的制備流程，工藝設備簡單，重復性好，所用原料易得，生產成本低，生產過程綠色環保；
[0015](2)采用本發明的方法，涂層的自組裝涂覆過程可在水相中進行，克服了由于硅烷化試劑自身水解而造成的涂覆質量問題，涂層的共價鍵合可利用感光聚合物重氮樹脂的光固化交聯反應方便可靠地實現，不易出現涂層脫落和毛細管堵塞等質量問題；
[0016](3)本發明方法制備的抗蛋白吸附毛細管電泳共價鍵合涂層柱，可用于對蛋白質、糖蛋白、肽鏈、激素、酶等生物的樣品的電泳分離檢測和純化等場合。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]附圖是典型的抗蛋白吸附共價鍵合涂層柱與石英毛細管裸柱對四種常見蛋白質電泳分離性能的比較。
【具體實施方式】
[0018]以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0019]蛋白質分離性能由CL-1020型毛細管電泳儀測得，被分析物中四種蛋白質(牛血清蛋白、溶菌酶、細胞色素C、核糖核苷酸酶A)的濃度均為0.5mg / ml，紫外檢測波長均為214nm,共價鍵合涂層柱與石英毛細管裸柱的有效長度均為41cm、內徑均為75 μ m,柱溫均為25°C，分離電壓均為+15kV，分離介質均為40mM濃度的磷酸鹽緩沖溶液(pH=3.0)。
[0020]實施例1
[0021]在1°C下，將新的石英毛細管裸柱先用濃度為0.0lmg / ml的重氮樹脂(分子量400)水溶液沖洗5分鐘，然后再用蒸餾水沖洗I分鐘。接著用濃度為0.0lmg / ml的聚苯乙烯磺酸鈉(分子量5000)水溶液沖洗5分鐘，然后再用蒸餾水沖洗I分鐘，這樣就完成了I個靜電自組裝循環。組裝I個循環后將毛細管用壓縮空氣吹干，置于波長為193nm的紫外燈下曝光，曝光劑量為5mJ / cm2,即可形成具有重氮樹脂-聚苯乙烯磺酸鈉2層復合結構的抗蛋白吸附共價鍵合涂層柱。由于石英毛細管內壁上的硅羥基與涂層間發生共價交聯反應而被屏蔽，因此該共價鍵合涂層柱具有良好的抗蛋白吸附性能。
[0022]實施例2
[0023]在50°C下，將新的石英毛細管裸柱先用濃度為100mg / ml的重氮樹脂(分子量100000)水溶液沖洗5分鐘，然后再用蒸餾水沖洗I分鐘。接著用濃度為100mg / ml的聚苯乙烯磺酸鈉(分子量600000)水溶液沖洗5分鐘，然后再用蒸餾水沖洗I分鐘，這樣就完成了 I個靜電自組裝循環。重復組裝6個循環后將毛細管用壓縮空氣吹干，置于波長為400nm的紫外燈下曝光，曝光劑量為20000mJ / cm2，即可形成具有重氮樹脂-聚苯乙烯磺酸鈉12層復合結構的抗蛋白吸附共價鍵合涂層柱。由于石英毛細管內壁上的硅羥基與涂層間發生共價交聯反應而被屏蔽，因此該共價鍵合涂層柱具有良好的抗蛋白吸附性能。
[0024]實施例3
[0025]在20°C下，將新的石英毛細管裸柱先用濃度為0.1mg / ml的重氮樹脂(分子量750)水溶液沖洗5分鐘，然后再用蒸餾水沖洗I分鐘。接著用濃度為0.1mg / ml的聚苯乙烯磺酸鈉(分子量10000)水溶液沖洗5分鐘，然后再用蒸餾水沖洗I分鐘，這樣就完成了 I個靜電自組裝循環。重復組裝5個循環后將毛細管用壓縮空氣吹干，置于波長為248nm的紫外燈下曝光，曝光劑量為30mJ / cm2，即可形成具有重氮樹脂-聚苯乙烯磺酸鈉10層復合結構的抗蛋白吸附共價鍵合涂層柱。由于石英毛細管內壁上的硅羥基與涂層間發生共價交聯反應而被屏蔽，因此該共價鍵合涂層柱具有良好的抗蛋白吸附性能。
[0026]實施例4
[0027]在35°C下，將新的石英毛細管裸柱先用濃度為10mg / ml的重氮樹脂(分子量5000)水溶液沖洗5分鐘，然后再用蒸餾水沖洗I分鐘。接著用濃度為10mg / ml的聚苯乙烯磺酸鈉(分子量100000)水溶液沖洗5分鐘，然后再用蒸餾水沖洗I分鐘，這樣就完成了 I個靜電自組裝循環。重復組裝4個循環后將毛細管用壓縮空氣吹干，置于波長為365nm的紫外燈下曝光，曝光劑量為6000mJ / cm2，即可形成具有重氮樹脂-聚苯乙烯磺酸鈉8層復合結構的抗蛋白吸附共價鍵合涂層柱。由于石英毛細管內壁上的硅羥基與涂層間發生共價交聯反應而被屏蔽，因此該共價鍵合涂層柱具有良好的抗蛋白吸附性能。
[0028]實施例5
[0029]在25°C下，將新的石英毛細管裸柱先用濃度為Img / ml的重氮樹脂(分子量2000)水溶液沖洗5分鐘，然后再用蒸餾水沖洗I分鐘。接著用濃度為Img / ml的聚苯乙烯磺酸鈉(分子量50000)水溶液沖洗5分鐘，然后再用蒸餾水沖洗I分鐘，這樣就完成了I個靜電自組裝循環。重復組裝2個循環后將毛細管用壓縮空氣吹干，置于波長為300nm的紫外燈下曝光，曝光劑量為2000mJ / cm2，即可形成具有重氮樹脂-聚苯乙烯磺酸鈉4層復合結構的抗蛋白吸附共價鍵合涂層柱。由于石英毛細管內壁上的硅羥基與涂層間發生共價交聯反應而被屏蔽，因此該共價鍵合涂層柱具有良好的抗蛋白吸附性能。
[0030]實施例6
[0031]在30°C下，將新的石英毛細管裸柱先用濃度為5mg / ml的重氮樹脂(分子量5000)水溶液沖洗5分鐘，然后再用蒸餾水沖洗I分鐘。接著用濃度為2mg / ml的聚苯乙烯磺酸鈉(分子量20000)水溶液沖洗5分鐘，然后再用蒸餾水沖洗I分鐘，這樣就完成了I個靜電自組裝循環。重復組裝3個循環后將毛細管用壓縮空氣吹干，置于波長為365nm的紫外燈下曝光，曝光劑量為4000mJ / cm2，即可形成具有重氮樹脂-聚苯乙烯磺酸鈉6層復合結構的抗蛋白吸附共價鍵合涂層柱。由于石英毛細管內壁上的硅羥基與涂層間發生共價交聯反應而被屏蔽，因此該共價鍵合涂層柱具有良好的抗蛋白吸附性能。
【權利要求】
1.一種抗蛋白吸附毛細管電泳共價鍵合涂層柱的制備方法，其特征在于利用水溶性的感光重氮樹脂作為一種帶正電的偶聯劑將帶負電的聚苯乙烯磺酸鈉通過靜電相互作用層層自組裝在石英毛細管柱的內壁上，經過紫外光照后重氮樹脂同時與石英毛細管內壁上的硅羥基和聚苯乙烯磺酸鈉的磺酸基發生光固化交聯反應，從而在石英毛細管內壁上形成穩定的重氮樹脂-聚苯乙烯磺酸鈉復合結構共價鍵合涂層。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的重氮樹脂的分子量在400至100000,水溶液的濃度為 0.0lmg / ml 至 100mg / ml。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的聚苯乙烯磺酸鈉的分子量在5000 至 600000,水溶液的濃度為 0.0lmg / ml 至 100mg / ml。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的重氮樹脂-聚苯乙烯磺酸鈉層層自組裝的溫度在I至50°C。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的重氮樹脂-聚苯乙烯磺酸鈉層層自組裝復合結構涂層的層數在2至12層。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的紫外曝光光源波長在193nm至400nm，曝光劑量為 5mJ / cm2 至 20000mJ / cm2。
7.根據權利要求2或3或4或5所述的制備方法，其特征在于最優工藝條件為:重氮樹脂的分子量為750至5000，聚苯乙烯磺酸鈉的分子量為10000至100000，重氮樹脂和聚苯乙烯磺酸鈉水溶液的濃度均為0.1mg / ml至10mg / ml,靜電自組裝的溫度在I至350C，層層自組裝涂層的層數為2至8層，紫外曝光光源波長在248nm至365nm，曝光劑量為3OmJ / cm2 至 6000mJ / cm2。
【文檔編號】G01N27/447GK104147927SQ201310608172
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年11月19日 優先權日:2013年11月19日
【發明者】叢海林, 于冰, 焦明明 申請人:青島大學