蛋白a免疫吸附柱的滅菌方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物材料及血液凈化領域，特別是涉及蛋白A免疫吸附柱的滅菌方法。
【背景技術】
[0002]蛋白A免疫吸附柱主要用于治療自身免疫性疾病。自身免疫性疾病是指人體的免疫系統發生紊亂，將自身的物質當成外來抗原，產生了一系列免疫反應，導致體內大量自身抗體及免疫復合物的產生，進而破壞人體組織、器官的一大類疾病的總稱。包括重癥肌無力、系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、格林巴利綜合癥等80余種疾病。由于病因不清，目前對該類疾病仍缺乏有效的藥物治療方法。利用蛋白A免疫吸附柱直接吸附清除病人血液中的自身抗體和免疫復合物，被公認為是目前治療該類疾病的最有效方法。蛋白A是金黃色葡萄球菌的細胞壁蛋白，該蛋白與抗體的Fe段有特異性相互作用，正是利用了蛋白A對抗體的高選擇性作用，利用固定化蛋白A合成的親和吸附柱能夠實現對自身免疫性疾病病人血液中大部分免疫復合物和自身抗體的快速清除。在十幾年的臨床應用中，蛋白A免疫吸附柱在治療自身免疫性疾病方面已顯示出藥物治療無法比擬的獨特療效。
[0003]蛋白A免疫吸附柱屬于三類醫療器械，必須保證產品的無菌性。市場上的蛋白A免疫吸附柱主要有Fresenius公司生產的Immunosorb和Prosorb兩種，由于蛋白A免疫吸附柱中的吸附劑具有滅菌敏感性，因此一般情況下蛋白A免疫吸附柱并不能進行熱壓滅菌或者輻照滅菌，其生產過程采用無菌工藝。通過基因改造的方法可以獲得特殊氨基酸序列的重組蛋白A，利用該蛋重組白A合成的吸附劑可以耐受蒸汽滅菌(CN 102398717 A)。
[0004]無菌工藝其工藝流程復雜，無菌保證水平較低(無菌工藝的無菌保證水平為千分之一，終端滅菌的無菌保證水平為百萬分之一)，一旦染菌也很難挽救損失。而耐受型重組蛋白A的獲得需要進行基因工程改造，想要獲得理想的目的蛋白工作量較大，目的蛋白的穩定性也需要充分考慮。
[0005]對于灌流器產品，最好的滅菌方法是蒸汽滅菌和輻照滅菌，目前市場上相當多的灌流器產品均采用這兩種方法，然而對于蛋白A免疫吸附柱，因這種極端條件的處理會導致吸附柱中活性成分蛋白A的降解變性，從而喪失從血液中清除致病物質的能力。
[0006]因此，為蛋白A免疫吸附柱尋找一種可行的滅菌工藝很有必要。
【發明內容】
[0007]基于此，本發明的目的在于提供一種蛋白A免疫吸附柱的滅菌方法，以實現蛋白A免疫吸附柱的滅菌。
[0008]本發明目的通過以下技術方案實現:
[0009]—種蛋白A免疫吸附柱的滅菌方法，其特征在于，包括以下步驟:將蛋白A免疫吸附劑置于pH為4?7的緩沖液中，裝柱后進行蒸汽滅菌。
[0010]在其中一些實施例中，所述方法還包括在所述緩沖液中添加穩定劑，所述穩定劑由以下組分組成:抗氧化劑、多元醇、多糖、螯合劑、增稠劑、多肽或蛋白。
[0011]在其中一些實施例中，所述穩定劑由以下重量份的組分組成:抗壞血酸鈉0.2?5份或焦亞硫酸鈉0.05?2份、甘油2?40份、甜菊糖I?20份、乙二胺四乙酸0.01?2份、水解明膠0.1?10份、白蛋白0.1?2份；所述穩定劑在緩沖液中的濃度為0.0326?
0.79g/mL0
[0012]在其中一些實施例中，所述穩定劑由以下重量份的組分組成:焦亞硫酸鈉0.1?
0.3份、甘油15?25份、甜菊糖13?15份、乙二胺四乙酸0.05?0.2份、水解明膠I?3份、白蛋白0.1?0.3份；所述穩定劑在緩沖液中的濃度為0.2925?0.438g/mL。
[0013]在其中一些實施例中，所述穩定劑由以下重量份的組分組成:焦亞硫酸鈉0.2份、甘油20份、甜菊糖15份、水解明膠2份、牛血清白蛋白0.2份、乙二胺四乙酸0.1份；所述穩定劑在緩沖液中的濃度為0.375g/mL。
[0014]在其中一些實施例中，所述緩沖液選自檸檬酸緩沖液、乙酸緩沖液、磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、酒石酸緩沖液、馬來酸緩沖液、硼酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液或乙磺酸緩沖液。
[0015]在其中一些實施例中，所述緩沖液的離子濃度為0.1?0.5M。
[0016]在其中一些實施例中，所述緩沖液的pH為5?6。
[0017]本發明中使用的蒸汽滅菌條件為12rC、15min(相當于標準滅菌時間FO =15min)，本發明中使用的降低的蒸汽滅菌條件為115°C、30min(相當于標準滅菌時間FO =8min)和100°C、60min (流通蒸汽滅菌條件，可以作為輔助滅菌手段)。
[0018]本發明中使用的pH值為4?7，優選pH值為5?6。pH對于維持滅菌后吸附劑的活性非常重要、合適的PH范圍對蛋白A構象穩定性起到作用。
[0019]本發明中使用的緩沖液的離子濃度為0.02?2.0M,優選0.1?0.5M，該濃度對于維持滅菌后吸附劑的活性是有益的，對于吸附劑的貯存穩定性也是有益的。濃度過低，緩沖能力不足；濃度過高，在貯存過程中可能會出現沉淀，此外，也會給臨床使用前的沖洗帶來不便。
[0020]本發明中使用的穩定劑有抗氧化劑、多元醇、多糖、螯合劑、白蛋白、增稠劑。抗氧化劑可以防止吸附劑中生物活性成分蛋白A在滅菌條件下被氧化；多元醇和多糖作為穩定劑的機理可以用“優先排阻效應”解釋，即多元醇或多糖存在時，其多羥基與溶劑分子形成氫鍵，使溶劑的表面張力增大，溶液粘度增加，對蛋白質產生排阻效應，蛋白的水化膜減小，結構更加緊湊，從而增加蛋白的穩定性；螯合劑可以絡合溶液中某些對蛋白活性有影響的金屬離子；白蛋白屬于蛋白類保護劑，作為經典、優良的穩定劑應用范圍很廣；增稠劑可以明顯防止白蛋白單獨存在時在高溫條件下聚集沉淀。
[0021]因此，本發明具有以下有益效果:
[0022]本發明所述滅菌方法，可以防止滅菌過程中蛋白A吸附柱中的活性成分蛋白A的降解變性，維持蛋白A的穩定性，通過這種滅菌工藝，可以使得吸附劑的活性在滅菌后得到保護，從而解決了蛋白A免疫吸附柱不能滅菌的問題，可以實現蛋白A免疫吸附柱產品的最終滅菌。
[0023]本發明所述滅菌工藝獲得的蛋白A免疫吸附柱產品，較無菌工藝獲得的產品，無菌保證水平更高，且生產成本更低。
【附圖說明】
[0024]圖1為實施例1的蛋白A吸附劑在不同pH條件下滅菌后的吸附活性圖；
[0025]圖2為實施例2的蛋白A吸附劑滅菌前后吸附活性圖；
[0026]圖3為實施例3的蛋白A吸附劑滅菌前后吸附活性圖；
[0027]圖4為實施例4的蛋白A吸附劑滅菌前后吸附活性圖；
[0028]圖5為實施例5的蛋白A吸附劑在不同滅菌條件下滅菌前后吸附活性圖。
【具體實施方式】
[0029]下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0030]實施例1
[0031]本實施例的滅菌方法如下:
[0032]取5g蛋白A吸附劑，加入5ml離子濃度為0.2M，pH3?10的緩沖液(其中pH3?6選擇檸檬酸緩沖液，pH7?8選擇磷酸緩沖液，pH9?10選擇甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)，裝瓶蒸汽滅菌，滅菌條件為100°C、60min。
[0033]然后按如下方法檢測滅菌前后吸附劑的吸附性能:
[0034]