一種灰飛虱有機磷殺蟲劑抗性快速檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種快速檢測灰飛虱有機磷殺蟲劑抗性的方法，屬于生物【技術領域】。以硝酸纖維素膜為載體，利用酯酶催化α-乙酸萘酯形成萘酯，再與固藍RR鹽發生耦聯反應，產生有色物質，然后根據顏色的深淺判斷樣本是否對有機磷殺蟲劑產生抗性。該方法包括硝酸纖維素膜、PH7.5磷酸緩沖液、PH6.0磷酸緩沖液、染色液等試劑。其優點是(1)快速，可以在1小時內完成樣本檢測；(2)操作簡單，且對操作人員要求較低，無需特定的儀器設備，一般人員簡單培訓后即可操作；(3)靈敏性更高，與靶標抗性分子檢測技術相比，可以檢測出較低水平的非靶標突變抗性。
【專利說明】一種灰飛虱有機磷殺蟲劑抗性快速檢測方法
一、【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及利用硝酸纖維素膜和3種溶液快速檢測灰飛虱對有機磷殺蟲劑的抗性。
二、技術背景
[0002]灰飛風Laodelphax striatellus FallSn是我國重要水稻害蟲之一,在所有稻區均有發生。除以成蟲、若蟲直接刺吸危害水稻、小麥外,還傳播水稻條紋葉枯病、黑條矮縮病等多種植物病毒病，其傳毒危害造成的損失巨大，嚴重時甚至顆粒無收，治蟲防病成為挽回損失的主要手段。
[0003]灰飛虱的防治一直以化學農藥為主，有機磷農藥是害蟲防治中常用的一類農藥。我國灰飛風防治最常用的有機磷農藥為毒死蝶。毒死蝶(英文通用名稱Chlorpyrifos,化學分子式C9H11C13N03PS)屬于膽堿酯酶抑制劑，是一種高效、廣譜、安全的有機磷殺蟲、殺螨劑。具有良好的觸殺、胃毒和熏蒸作用以及強內吸性和高殺蟲活性，可防治多種害蟲，與常規有機磷農藥相比毒性低，使用安全，是農業部推薦的用于灰飛虱防治的主要藥劑之一。但是由于生物對逆境具有一定的進化適應性，抗藥性的產生是殺蟲劑使用的必然代價。抗性檢測表明浙江省嘉興、寧波和湖州地區，江蘇省通州、楚州、大豐、南京和蘇州地區灰飛虱對毒死蜱產生了低水平抗性。江蘇省句容、建湖和武進地區、安徽廬江、福建福州和廣東廣州等地灰飛虱對毒死蜱產生了中等水平的抗性。抗性機理研究結果證實酯酶活性上升是促進灰飛虱對機磷殺蟲劑產生抗性的重要因子。
[0004]抗性水平的監測是制定綜合防治措施，有效治理害蟲的先決條件。有3種方法可以檢測害蟲對殺蟲劑是否產生抗性，即生測法、生化法和分子檢測法。生測法為傳統的抗性檢測方法，該方法可以得到害蟲對殺蟲劑的抗性倍數，但是存在兩方面的問題。一是所需時間長，完成整個生測需要2-5天，但是害蟲發育較快，一般2天即可發育到下一齡期，因此在得到生測結果后有可能錯過最佳防治時期。二是需要花費大量的人力。分子檢測法源于分子生物學的發展，該方法要求明確殺蟲劑抗性靶標基因和相關突變，對非靶標抗性難以檢測，而害蟲抗性發展的一般規律是先產生代謝抗性，然后再產生靶標抗性，因此靶標抗性一般與高水平抗性有關，在產生低水平抗性時，其靶標基因突變頻率極低，難以檢測。生化法根據害蟲抗性產生機理，測定相關代謝酶的活性，從而判斷害蟲是否產生抗性，可以檢測較低水平的抗性。傳統生化檢測，需要在田間收集試蟲，然后在室內用酶標儀測定，因此對檢測人員在技術上有一定的要求。本發明即源于該方法，但是借鑒了酶聯免疫法的優點，采用硝酸纖維素膜為載體，可以快速簡單地檢測試蟲是否對有機磷殺蟲劑產生抗性，對操作人員要求低。
[0005]2、技術方案
[0006]為達到快速簡單檢測有機磷殺蟲劑抗性的目的，本發明借鑒酶聯免疫斑點法的優點，將酯酶固定在硝酸纖維素膜上，然后通過染色和漂洗，根據染色后斑點的顏色判斷灰飛虱是否對有機磷殺蟲劑產生抗性，具有快速簡單的優勢。[0007]本發明為一種快速檢測灰飛虱有機磷殺蟲劑抗性的方法，由硝酸纖維素膜、磷酸緩沖液、染色液等組成。
[0008]3、有益效果
[0009]本發明與現有技術相比，可以產生以下效果:
[0010](I)快速:生物測定方法測定試蟲對殺蟲劑的抗性一般需要48-120小時才能得到結果，而該方法只需要I小時即可判斷試蟲對有機磷殺蟲劑是否產生抗性。
[0011](2)操作簡單，且對操作人員要求低:不管是傳統的生測法、生化法還是分子檢測法都要求操作人員有相關的專業背景，需要受過相關的專業培訓，而且相關檢測工作較繁瑣并需要有相應的儀器設備。而本發明只需適量硝酸纖維素膜，再配合3種不同的溶液即可完成對樣本的檢測，因此操作簡單，對操作人員的專業素質要求較低，只需簡單培訓，就能進行相關檢測工作。
[0012](3)靈敏性高:與分子檢測技術相比可以檢測更低水平的抗性。
四、【具體實施方式】
[0013]試劑:
[0014]溶液A:PH7.5磷酸鈉緩沖液。
[0015]溶液B:PH6.0磷酸鈉緩沖液。
[0016]溶液C: α -乙酸萘酯、固藍RR鹽溶于ΡΗ6.0磷酸鈉緩沖液。
[0017]硝酸纖維素膜
[0018]酯酶活性檢測:
[0019]取試蟲置于離心管中，然后加入溶液Α，勻漿棒研磨均勻。取0.5μ I酶液，滴在硝酸纖維素膜上，晾干。然后將晾干后的硝酸纖維膜浸在溶液C中5min，取出膜，用溶液B漂洗2min，取出后即觀察顏色，以敏感品系為標準，比較斑點顏色的深淺判斷試蟲是否產生抗性。
[0020]實施例1:
[0021]取毒死蜱抗性試蟲5頭，研磨后，將酶液等比例稀釋，共6個濃度，然后進行染色。結果如附圖1。根據該結果可知硝酸纖維素膜染色的深淺與酯酶的含量呈正比。
[0022]實施例2:
[0023]取毒死蜱抗性和敏感品系單頭灰飛虱，研磨后染色，結果見附圖2。根據該結果可知抗性品系4個體具有較高的酯酶活性，I個體酯酶活性略低，而敏感品系所有個體酯酶活性均較低，由此推斷抗性品系中抗性個體頻率為80%左右。
五、【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1利用本方法檢測不同濃度酯酶。
[0025]圖2利用本方法檢測毒死蜱抗性和敏感試蟲的酯酶。
[0026]在圖1中，以、2乂、4乂、8乂、16乂、32乂分別表示原始酶液以及原始酶液稀釋2倍、4倍、8倍、16倍和32倍；CK表示清水對照
[0027]在圖2中，“敏感”示該行檢測的5個樣本取自敏感品系；“抗性”示該行5個樣本取自毒死蜱抗性品系。
【權利要求】
1.一種對灰飛虱有機磷殺蟲劑抗性快速檢測的方法，其特征是以硝酸纖維素膜為載體，比較樣本與敏感品系酯酶斑點的顏色，根據顏色的深淺來判斷樣本是否產生抗性。操作時將少量酶液固定于硝酸纖維素膜上后通過與底物α-乙酸萘酯反應，產生萘酯，然后與固藍RR鹽耦聯，形成有色偶氮染料，從而在硝酸纖維素膜上顯出顏色。然后根據顏色的深淺來判斷樣本是否產生抗性。
【文檔編號】G01N33/544GK103558375SQ201310570981
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月18日 優先權日:2013年11月18日
【發明者】王利華, 羅光華, 張月亮, 姚靜, 方繼朝 申請人:江蘇省農業科學院