預防和/或逆轉新發作自身免疫糖尿病的基于微球的組合物的制作方法
【專利說明】預防和/或逆轉新發作自身免疫糖尿病的基于微球的組合 物
[0001] 本申請是國際申請日2007年8月6日、國際申請號PCT/US2007/075292于2009 年2月3日進入中國國家階段、申請號200780028951. 8、發明名稱"預防和/或逆轉新發作 自身免疫糖尿病的基于微球的組合物"的申請的分案申請。
[0002] 發明描述
[0003] 本申請要求2006年8月4日提交的美國臨時申請No. 60/835, 742和2006年11 月8日提交的美國臨時申請No. 60/864, 914的優先權。上述各申請的全部內容在此引入作 為參考。
[0004] 發明背景
[0005] 總的來說，本公開涉及在N0D小鼠中預防和/或逆轉自身免疫糖尿病病癥的反義 方法。這包括通過注射微球投送AS-寡核苷酸以獲得引起負調節活性的治療效果，具體是 在非肥胖型糖尿病（N0D)小鼠模型中。微球使用完全水性的條件制造，該微球中結合有一 種或多種反義（AS)寡核苷酸。
[0006] 微粒、微球和微囊是固體或半固體的顆粒，其直徑小于1毫米，也可以小于100微 米，它們可以由各種不同的材料形成，包括合成聚合物、蛋白和多糖。微球已經被用于許多 不同的應用中，主要是分離、診斷和藥物投送。
[0007] 有許多不同的技術可用于從合成聚合物、天然聚合物、蛋白和多糖制造這些顆粒， 包括相分離、溶劑蒸發、乳化和噴霧干燥。一般來說，聚合物形成這些微球的支撐結構，而 目標藥物結合在聚合物結構中。用于形成微球的示例性聚合物包括在Ruiz等的美國專 利 No. 5, 213, 812、Reid 等的美國專利 No. 5, 417, 986、Tice 等的美國專利 No. 4, 530, 840、 Tice等的美國專利No. 4, 897, 268、Tice等的美國專利No. 5, 075, 109、Singh等的美國專 利 No. 5, 102, 872、Boyes 等的美國專利 No. 5, 384, 133、Tice 等的美國專利 No. 5, 360, 610、 以及南方研究所（Southern Research Institute)的歐洲專利申請公布No. 248, 531中描 述的乳酸和乙醇酸的均聚物或共聚物（PLGA);在Ilium的美國專利No. 4, 904, 479中描述 的嵌段共聚物例如Tetronic? 908和泊洛沙姆（poloxamer)407 ;以及在Cohen等的美國專 利No. 5, 149, 543中描述的聚磷腈。使用例如這些聚合物生產的微球表現出荷載效率差，通 常僅能在聚合物結構中結合少量百分比的目標藥物。因此，為了獲得療效，通常必須施用相 當大量的這些類型的微球。此外，這些聚合物一般是疏水性的，對目標藥物的溶解有負性影 響。在這種情況下使用的典型聚合物包括聚乳酸乙醇酸（PLGA)。
[0008] 醫療團體的目標是將核酸投送到動物細胞中以治療各種疾病，包括糖尿病。在許 多方法中，通過加入轉染劑，能夠相對有效地將核酸投送到培養細胞中（體外）。此外，在體 內，當給動物投送核酸時，內源核酸酶的存在將導致核酸高速降解。
[0009] 除了保護核酸免受核酸酶消化之外，核酸投送載體還必需表現出低毒性，必須被 細胞有效攝取，并且具有定義明確的、容易制造的配方。臨床試驗中顯示，用于投送的病毒 載體在體內能導致嚴重的不利、甚至是致命的免疫應答。此外，這種方法有可能在體內有致 突變效應。通過將核酸復合在不同配方的脂質復合物（例如脂質體或陽離子脂質復合物） 中進行投送，可能具有有毒的效應。核酸與各種聚合物或與肽的復合物顯示出不一致的結 果，并且這些配方的毒性還沒有解決。核酸還已經被包裹在聚合物基質中進行投送，但是在 這些情況下顆粒的粒度范圍廣，并且治療性應用的有效性還沒有被證實。這些早先的方法 能產生與這里所希望的目標相反的效果，包括免疫系統的刺激。例如，當PLGA被摻入到顆 粒中時，PLGA的存在刺激了免疫系統。
[0010] 因此，對于解決核酸投送中的問題存在著需求，對于微球的開發和制造微球的新 方法有正在發展的需求。關于微球的詳細情況，特別是關于它們的制備和性質的詳細情 況,可以在Scott等的美國專利No. 6, 458, 387, Woiszwillo等的美國專利No. 6, 268, 053、 No. 6, 090, 925、No. 5, 981，719 和 No. 5, 599, 719, Woiszwillo 的美國專利 No. 5, 578, 709 以 及Brown等的美國申請公布No. 2006/0024240中找到。這些以及所有在本文中指明的參考 文獻在此引為參考。
[0011] 發明簡沭
[0012] 按照本公開，寡核苷酸作為微球投送。據信這樣的投送方法阻止了核酸酶接近微 球內的核酸。進行反義（AS)寡核苷酸的微球投送以誘導樹突狀細胞耐受，特別是在N0D小 鼠模型中。使用水性條件制造微球，使得反義（AS)寡核苷酸被結合。這些微球用于抑制基 因表達，并用于在N0D小鼠中體內預防和/或逆轉自身免疫糖尿病病癥。
[0013] 在本公開的一個方面，合成了靶向⑶40、⑶80和⑶86轉錄物的三種AS-寡核苷 酸，制備了寡核苷酸混合物的水溶液，并與水性聚合物溶液合并。形成含有寡核苷酸的微 球，通過注射將它們投送到N0D小鼠中。
[0014] 在本公開的一個方面，提供了用于在哺乳動物中逆轉1型糖尿病的方法，包括施 用微球組合物，其中組合物中的微球含有與選自CD40、CD80和CD86初級轉錄物的初級轉錄 物及其組合是反義的并與它們定向結合的寡核苷酸。該寡核苷酸選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3,或事實上可以是任何其它以⑶40、⑶80和⑶86為靶標的寡核苷酸。
[0015] 本公開的另一個方面涉及保護哺乳動物胰腺P細胞免于自身免疫破壞的方法， 包括在哺乳動物中注射微球組合物，其中組合物中的微球含有與選自⑶40、⑶80和⑶86初 級轉錄物的初級轉錄物及其組合是反義的并與它們定向結合的寡核苷酸。
[0016] 另一個方面是在哺乳動物中減少T細胞介導的胰腺炎癥和/或胰腺0細胞死亡 的方法，包括給哺乳動物施用微球組合物，其中組合物中的微球含有與選自⑶40、⑶80和 CD86初級轉錄物的初級轉錄物及其組合是反義的并與它們定向結合的寡核苷酸，其中組合 物以在哺乳動物中有效緩解1型糖尿病癥狀的量施用。在更加限定的方面，該組合物在1型 糖尿病臨床發作之后施用。在備選的方面，該組合物在1型糖尿病臨床發作之前施用。在 這些治療性方面，與施用前哺乳動物的血糖水平相比，組合物的施用使哺乳動物中的血糖 水平歸于正常。
[0017] 施用組合物可以再生哺乳動物的0細胞群，或終止0細胞種的進一步惡化，或這 二者。
[0018] 組合物可以以任何形式施用，在某些示例性方面，以注射形式施用。在特定方面， 組合物與胰島素一起組合施用。在使用組合療法時，可以在施用微球組合物之前、同時或之 后施用胰島素。
[0019] 其它方面還涉及在患有新發作或臨床前期自身免疫糖尿病的對象中保護剩余的 3細胞團的方法，包括給對象施用含有微球的組合物，該微球中含有與⑶40、⑶80和⑶86 初級轉錄物是反義的并與它們定向結合的寡核苷酸，其中組合物的施用將哺乳動物的3 細胞團維持在糖尿病發作前存在的細胞團的至少15%。對象可以是人類對象。對象可以 是人類兒童。治療方法可以包括重復施用組合物，并且重復施用增加了哺乳動物的3細胞 團。
[0020] 在具體定義的方法中，微球的30%以及多達70% w/w是寡核苷酸。這樣的組合物 通常可以在微球組合物中含有比例為1:1:1的反義⑶40:反義⑶80:反義⑶86。
[0021] 通過下面的具體說明，本發明的這些以及其它的方面、目標、特點和