3350、PEG 8000、PEG 10000、PEG 20000 等， 以及各種不同分子量的泊洛沙姆例如泊洛沙姆188和Pluronic FI27或Pluronic F68。常 用的聚合物是聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。另一種聚合物是羥乙基淀粉。其它的兩親性聚合物 也可以單獨或組合使用。相分離增強劑也可以是非聚合物，例如丙二醇和乙醇的混合物。
[0051] 在典型的實施方案中，可以制備聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙二醇的聚合物溶液， 并與其它溶液合并。加熱、冷卻、離心和清洗多次提供水性懸浮液，通常被冷凍和凍干，以形 成含有寡核苷酸和聚陽離子的微球的干粉。
[0052] 微球適合通過注射途徑體內投送，例如靜脈內、肌內、皮下、腹膜內、鞘內、硬膜外、 動脈內、關節內等。其它可以實施的投送途徑包括例如局部、口、直腸、鼻、肺、陰道、頰、舌 下、經皮、經粘膜、耳或眼內。
[0053] 不受任何具體理論的束縛，據信含有本文例舉的反義寡核苷酸的微球下調細胞表 面分子⑶40、⑶80和⑶86。注射微球，據信樹突狀細胞主動攝取寡核苷酸微球。這些寡核 苷酸抑制了樹突狀細胞中細胞表面細胞分子CD40、CD80和CD86的表達。在N0D小鼠中，施 用這些開發后的反義寡核苷酸微球，有效地逆轉了糖尿病。
[0054] 下面的實施例說明了本公開的某些特點和優點，以對本公開進行進一步的說明。 實施例不應該被視為限制或局限了本發明。
[0055] 實施例1
[0056] 合成了三種靶向⑶40、⑶80和⑶86初級轉錄物的AS-寡核苷酸。在本實施例中 施用的AS-寡核苷酸序列顯示如下，其中星號表示骨架中巰基化的位點：
[0057] Seq ID 1:CD 40-AS:5'-C*AC*AG*C C*GA*GG*C*AA*AGA*C*AC*C A*T*G OAG*GG*C*A-3'
[0058] Seq ID 2:CD80_AS:5'_G*GG*AA*A G*CC*AG*G A*AT*CT*A
[0059] G*AG*CC*A A*TG G*A-3'
[0060] Seq ID 3:CD86-AS:5'-T*GG*GT*G C*TT*COG T*AA*GT*T C*TG*GA*A OAC*G*T*C_3'
[0061] 通過將各含有一種類型寡核苷酸的三種寡核苷酸溶液等份合并，制備寡核苷酸 混合物的水性溶液，形成三種類型寡核苷酸的l〇mg/ml溶液。在去離子水中制備了 10mg/ ml的聚L-賴氨酸? HBr溶液（聚L-賴氨酸? HBr最高為70, 000道爾頓，Bachem，King of Prussia，PA)。將聚L-賴氨酸? HBr以1:1的體積比加入到寡核苷酸溶液中。將混合 物輕柔潤旋。以2:1的體積比加入在pH5. 5的1M乙酸鈉（Spectrum, Gardena, CA)中含有 12. 5% PVP (聚乙烯吡咯烷酮，40, 000 道爾頓，Spectrum Chemicals, Gardena, CA)和 12. 5% PEG(聚乙二醇，3, 350 道爾頓，Spectrum Chemicals, Gardena, CA)的 25%聚合物溶液，如 下：0. 75mlAS-寡核苷酸，0. 75ml 聚 L-賴氨酸? HBr，3. 0ml PEG/PVP，總體積為 4. 50ml。
[0062] 將批料在70°C溫育30分鐘，然后冷卻到23°C。冷卻后，溶液變得渾濁，微球形成。 然后將懸浮液離心，除去過量的PEG/PVP。通過將沉淀重新懸浮在去離子水中來清洗得到的 沉淀，然后離心并除去上清液。清洗步驟重復三次。將水性懸浮液冷凍并凍干，以形成含有 寡核苷酸和聚L-賴氨酸的微球的干粉。
[0063] 圖la和b顯示了兩種不同放大倍數的1:1比例的聚L-賴氨酸：寡核苷酸微球的 代表性掃描電鏡照片（SEM)。制造了 0. 5-4 ii m大小、平均粒度大約2. 5 ii m的微球。圖2a 顯示了通過激光散射揭示的按照本公開制造的一種微球制劑的大小分布。圖2b顯示了通 過光散射測定的微球制劑表面電荷（〖電勢）。圖3顯示了在微球分解后用于定量反義寡 核苷酸組分的載量和評估其完整性的反相（RP)HPLC方法。使用⑶86、⑶40、⑶80寡核苷 酸和聚L-賴氨酸（PLL;MW 30-70kD)來配制微球。然后使用聚L-天冬氨酸（PAA)對PLL 的競爭性置換DNA寡核苷酸來使微球分解。PAA被選作在260nm處沒有吸收并且不干擾在 260nm處對寡核苷酸定量的聚氨基酸試劑。在RP-HPLC圖譜，如圖3中，每個峰下的面積與 微球中荷載的每種寡核苷酸的量成比例。如圖3中所示，峰的高度表明在微球中每種寡核 苷酸大致相等的載量。微球中寡核苷酸的載量經計算為重量的大約65%到大約80%。圖 3還顯示了寡核苷酸的完整性沒有受到微球配制過程的影響，這由分解后峰的狹窄分布表 明。
[0064] 實施例2
[0065] 在本實施例中，顯示了覆蓋本公開的預防方面的試驗結果。如圖4所示，在5-8周 齡的N0D小鼠中單次施用AS-MSP延遲了糖尿病發作。對兩組雌性N0D小鼠（5-8周齡）單 次皮下注射配制成本公開的微球的反義寡核苷酸（AS-MSP)。制劑以被認為含有每種反義寡 核苷酸（抗⑶40、抗⑶80和抗⑶86)的1:1:1混合物50 ii g的量進行注射。其它組的小鼠 注射錯義序列的微球（SCR-MSP)或PBS介質（對照N0D)。每周通過尾部靜脈穿刺測量血 糖。在兩次連續讀數>280-300mg/dL后，證實糖尿病。圖4顯示了兩個獨立治療組群的累 計存活率。
[0066]圖5顯示在5-8周齡的N0D小鼠中多次施用AS-MSP防止了糖尿病發作。對N0D 雌性小鼠（5-8周齡）連續8次單劑皮下注射（每周一次）配制成本公開的微球的反義寡 核苷酸。注射（每種反義寡核苷酸的1:1:1的混合物或錯義寡核苷酸50 y g)每周給予一 次，為期8周，在第13周停止。其它組的小鼠注射錯義序列的微球（SCR-MSP)或PBS介質 (對照NOD)。圖5顯示了治療的動物的累計存活率。
[0067] 圖6a和6b顯示了沒有接受治療、因此自發發展成自身免疫性的小鼠（糖尿病N0D 小鼠）的胰腺組織切片，用蘇木精和曙紅染色（H+E ;圖6a)或對胰島素進行染色（圖6b)。 圖6c和6d顯示了用SCR-MSP制劑治療的小鼠（與用特異性AS-MSP治療的組平行開始注 射）的胰腺組織的切片。這些切片也用蘇木精和曙紅染色（H+E;圖6c)或對胰島素進行染 色（圖6d)。SCR-MSP小鼠都發展出糖尿病。
[0068] 圖7a和7b顯示了在不到8周齡時治療（預防模型）和用本公開的反義微球治療 的小鼠的胰腺組織切片，用蘇木精和曙紅染色（H+E ;圖7a)或對胰島素進行染色（圖7b)。
[0069] 圖8中顯示，來自AS-MSP治療的N0D小鼠的T細胞表現出Foxp3+⑶25+推定的 1；%細胞的優勢增加。圖8A顯示用于FACS分析的門（gating)。圖8B顯示從脾臟富集的 Foxp3+⑶25+T細胞的百分率，圖8C顯示來自集合淋巴結的百分率，所述淋巴結來自ASMSP 無糖尿病組群隨機選擇的ASMSP治療的無糖尿病小鼠或來自用錯義序列微球（SCR-MSP)治 療的或用PBS介質治療的動物。
[0070] 圖9顯示了來自ASMSP治療的無糖尿病N0D小鼠的T細胞在與同系脾細胞共培 養時的增殖。來自ASMSP治療的無糖尿病N0D小鼠的T細胞通過富集柱獲得，并與來自于 Balb/c、C57BL6或同系無糖尿病N0D小鼠（10周齡）的Y射線輻照過的脾細胞共培養。在 四天后使用Cyquant試劑測量增殖。Spl是指同系的輻照過的脾細胞。
[0071] 圖10顯示了來自ASMSP治療的、無糖尿病N0D小鼠的T細胞在同系的輻照過的脾 細胞和卵清蛋白的存在下的體外增殖。T細胞從在ASMSP無糖尿病組群中隨機選擇的ASMSP 治療的無糖尿病小鼠的脾臟或集合淋