優點，包括其 各種組合，將得到明顯和清楚的理解。
[0022] 附圖簡沭
[0023] 在本說明的過程中，將對附圖進行參考，其中：
[0024] 圖la和lb是AS-寡核苷酸和聚L-賴氨酸聚陽離子微球的掃描電鏡照片。
[0025] 圖2a和2b是顯示本公開的微球制劑性質的圖。圖2a是顯示微球制劑大小的圖。 圖2b是顯示微球制劑的表面電荷的圖。
[0026] 圖3是微球分解（deformulation)后寡核苷酸的RP-HPLC色譜圖。
[0027] 圖4是顯示了與用錯義（scrambled)寡核苷酸微球或只用PBS載體治療的動物相 t匕，在用本發明的反義寡核苷酸微球（AS-MSP)治療多次的N0D小鼠中對糖尿病的防止的繪 圖。
[0028] 圖5是顯示了與用錯義寡核苷酸微球或只用PBS載體治療的動物相比，在用本公 開的AS-MSP治療一次的N0D小鼠中對糖尿病的防止。
[0029] 圖6a_6d是用蘇木精和曙紅染色（圖6a和c ;H+E)或對膜島素進彳丁染色（圖6b 和6d)的對照NOD小鼠胰腺組織切片的光學顯微鏡照片。
[0030] 圖7a_7d是用蘇木精和曙紅染色（圖7a和c ;H+E)或對膜島素進彳丁染色（圖7b 和7d)的AS-MSP治療的NOD小鼠胰腺組織切片的光學顯微鏡照片。
[0031] 圖8顯示了從本公開的AS-MSP治療的小鼠或對照動物獲得的T細胞的FACS分析。
[0032] 圖9顯示了相對熒光強度（RFI)圖，證實了來自以本公開的AS-MSP治療的動物并 與脾細胞一起培養的T細胞的增殖。
[0033] 圖10顯示了 RFI圖，證實了來自AS-MSP治療的無糖尿病N0D小鼠的T細胞在同 系的被輻照脾細胞和卵清蛋白的存在下的體外增殖。
[0034] 圖11顯示了 RFI圖，證實了來自AS-MSP治療的無糖尿病N0D小鼠的T細胞在同 系胰島裂解物的存在下體外增殖受抑制。
[0035] 圖12是新發作糖尿病小鼠用含有反義或錯義寡核苷酸的微球治療的血糖水平 圖。
[0036] 圖13A顯示了用患有新發作糖尿病的小鼠進行實驗的時間線，圖13B和13C是用 AS-MSP或對照進行治療的新發作糖尿病小鼠的平均血糖水平圖。
[0037] 圖14A-C顯示了 N0D小鼠中1型糖尿病表型的逆轉。這些圖顯示了在施用AS-MSP 后，哺乳動物的血糖水平在15天內回復到正常（正常水平用虛線顯示，大約為200mg/dL)， 并且甚至在停止AS-MSP的施用后（第30天）仍維持正常。
[0038]圖15描繪了自身免疫糖尿病的治療性逆轉的模式。
[0039]說明件實施方案的描沭
[0040]按照需要，在這里公開了本公開的詳細實施方案；但是，應該理解，公開的實施方 案僅僅是本公開的示例，它可以以各種形式體現。因此，本文公開的具體細節不應該被解釋 為是限制性的，而僅僅是作為權利要求書的基礎，以及作為給本領域專業人員講授的代表 性基礎，以便以實際上任何適合的方式多樣性運用本發明。
[0041]I型糖尿病是一種自身免疫疾病，其中胰腺，具體來說是產生胰島素的內分泌3 細胞，存在著進展性炎癥。在發病前，炎癥首先使內分泌0細胞功能障礙。在人類自身免 疫（1型）糖尿病的非肥胖型糖尿病（N0D)小鼠模型中，單次注射微球制劑明顯延遲了疾病 的發作。盡管不希望受到任何具體理論的束縛，但據信在疾病發作前，微球被注射位點的駐 留性和遷移性樹突狀細胞攝取，然后移動到鄰近的淋巴結中。還認為在被治療的受體中，發 生了靶向推定0細胞抗原的T細胞的體外增殖降低。在免疫缺陷的N0D-SCID小鼠中，通 過用同系T細胞和樹突狀細胞重建然后再施用微球，可以發生⑶4+⑶25+推定的調節T細 胞優勢增加。因此，基于微球的治療性組合物可以調節樹突狀細胞活性并動員調控網絡進 行預防。
[0042]能夠防止糖尿病發作的治療方法是合乎需要的。當臨床發病后顯著數量的@細 胞已經被破壞時，能夠遏制或逆轉疾病的治療性組合物也是合乎需要的。在新發作糖尿病 的小鼠中重復用藥使高血糖歸于正常，并逆轉了疾病。逆轉一般表示使個體，例如人類或其 它哺乳動物，表現出接近正常的血糖水平。不受任何具體理論的束縛，據信在"逆轉"期間， 疾病誘導的T細胞炎癥和細胞死亡被抵制了。
[0043] 一個實施方案通過配制和注射本文描述的、以⑶40、⑶80和⑶86轉錄物為靶標的 反義（AS)寡核苷酸微球，逆轉了自身免疫胰島素依賴性糖尿病。針對轉錄物的反義寡核苷 酸的具體例子公開在本文的實施例中。應該理解，也可以設計其它與CD40、CD80和CD86轉 錄物有效結合的反義寡核苷酸，以獲得本文描述的效果。還應該理解，這樣的寡核苷酸可以 結合本領域已知的修飾，包括但不限于巰基化（thioation)、甲基化和甲氧乙基化，并且這 些修飾的位置和數量可以被改變，以獲得最優效果。這些寡核苷酸被設計用于誘導免疫耐 受，這樣導致在N0D小鼠模型中產生胰島素的0細胞的破壞被逆轉。
[0044] 在N0D小鼠以及人類中，1型糖尿病被證實是由于產生胰島素的胰腺0細胞被自 身免疫破壞。在臨床發病時，人類通常具有10-20%以下的殘留P細胞團。散在的任何該 殘留細胞團可以產生足以調節葡萄糖水平的殘余胰島素水平。此外，逆轉0細胞破壞可以 導致0細胞群的部分再生。提供本公開的含有寡核苷酸的微粒是為了干擾0細胞的自身 免疫破壞。
[0045] 應該認識到，能夠被激活的樹突狀細胞（DC)是在所有組織中發現的強抗原呈遞 細胞，它們存在于皮膚下。這些抗原呈遞樹突狀細胞的功能是通過活化T細胞作為免疫應 答、包括自身免疫應答的引發物，特別是在淋巴結中。盡管不希望受到理論的束縛，但據信 ⑶40、⑶80和⑶86對于自身免疫應答是重要的，這些分子的下調被認為促進了自身免疫的 低應答性。此外，某些細胞因子例如干擾素和白介素，因為低應答性而降低。
[0046] 在制備用于在小鼠中治療自身免疫糖尿病的微球中，可以將一種、兩種或三種 AS-寡核苷酸溶解在水性溶液中，并與水溶性聚合物和聚陽離子合并。溶液通常在大約 60-70°C溫育，冷卻到大約23°C，并除去過量的聚合物。
[0047] 核酸通常占微球的大約30到大約100重量％，平均粒度不超過大約50微米，通常 不超過大約20微米，并可以不超過大約10微米。它們通常如下制備。制備寡核苷酸的水 溶液。在要制備含有三種寡核苷酸的微球時，將三種寡核苷酸溶液等份合并。每種溶液含 有這三種寡核苷酸類型的一種。含有寡核苷酸的終溶液通常含有大約l〇mg/ml寡核苷酸。
[0048] 在特定的實施例中，微球制劑含有65%、70%、75%、80%，85%、90% w/w或更多 的寡核苷酸載量。在這樣的實施方案中，組合物具有6-10% w/w的聚L-賴氨酸含量。此 外，微球的水分含量是變化的，可以為大約4%。寡核苷酸以1:1:1的反義⑶40:反義⑶80: 反義⑶86的比率存在。
[0049] 將它們與10mg/ml聚陽離子儲存液的等份合并。聚陽離子的例子是聚賴氨酸和聚 鳥氨酸。其它包括聚乙烯亞胺（PEI)、谷醇溶蛋白、魚精蛋白、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、聚精 氨酸、乙烯胺、以及帶正電荷多糖的衍生物例如帶正電荷殼聚糖，及其組合。聚陽離子溶液 中聚陽離子：寡核苷酸的體積比可以從大約1:1到大約4:1。常用的聚陽離子包括聚L-賴 氨酸*HBr (最高達70, 000道爾頓，可以從Bachem獲得）和聚L-鳥氨酸*HBr (例如11，900 道爾頓，可以從Sigma獲得）。
[0050] 還制備了聚合物溶液。它們可以用作相分離增強劑。適合的聚合物的例子包括線 性或分支的聚合物、共聚物和嵌段共聚物。這些聚合物可以是水溶的、半水溶的、與水混溶 的的或可溶于與水混溶的溶劑中的。聚合物的例子包括可藥用添加劑，例如各種不同分子 量的聚乙二醇（PEG)，如 PEG 200、PEG 300、PEG