巴結富集。
[0072] 圖11顯示了來自ASMSP治療的、無糖尿病N0D小鼠的T細胞，在同系的胰島裂解 物的存在下在體外表現出增殖抑制。T細胞從圖4描述的ASMSP無糖尿病組中隨機選擇的 ASMSP治療的無糖尿病小鼠的脾臟或集合淋巴結富集。輻照過的N0D脾細胞（來自10周齡 的無糖尿病N0D小鼠）被用作抗原呈遞細胞，平行培養物用NIT-1裂解物（1 y g/孔）（或 PBS介質）脈沖。
[0073] 對于人類試驗中糖尿病抑制療法的最終結果（translation)的主要顧慮是治療 方法的抗原特異性（以及因此的細胞特異性），以及治療是否造成全面的非特異性抑制。為 了解決這些問題，將從圖4顯示的組群中隨機選擇的無糖尿病小鼠處以安樂死，以確定脾 臟和淋巴結T細胞對同種異體抗原、規定（nominal)抗原（以完整的卵清蛋白的形式）和來 自N0D衍生的胰島瘤細胞系NIT-1的細胞裂解物形式的同系0細胞衍生抗原的增殖。盡 管胰島素和谷氨酸脫羧酶（GAD)是在機理和目的上有牽連的候選自身抗原，但啟動自身抗 原的本質仍然不清楚。然而，可以合理地認為它應該是0細胞駐留性的。因此，源自于N0D 胰島瘤的NIT-1細胞系被用作3細胞抗原的來源，與來自AS-MSP治療的無糖尿病NOD小 鼠的T細胞共培養，以確定抗原特異性低應答性的可能性。從這些研究可以看到，對規定的 和同種異體抗原的T細胞增殖得到了維持，而在與NIT-1細胞裂解物共培養中存在T細胞 低增殖。
[0074] 此外，為了確定共培養上清液中的細胞因子，我們觀察到來自AS-MSP治療的無糖 尿病N0D小鼠的T細胞，即使在NIT-1裂解物的存在下，也明顯減少TNF a的產生。盡管在 AS-MSP治療的小鼠的T細胞的共培養物中，IFN Y的生產略有減少，但它與在NIT-1裂解物 存在下、與PBS治療小鼠的T細胞的共培養物沒有統計學上的可區別性。最后，該分析不能 檢測到上清液中IL-4、IL-10或TGFP的存在。
[0075] 實施例3
[0076] 還測試了反義寡核苷酸微球在早期發作N0D小鼠中逆轉糖尿病癥狀的能力。這些 實驗的時間線顯示在圖13A中。通過測試血糖水平并鑒定血糖水平大于400mb/dL的動物， 選擇了具有早期發作的N0D小鼠。給選出的動物胰島素粒，使血糖水平正常，低于300mg/ dL的正常水平。撤銷胰島素，開始進行一系列腸胃外微球注射。6只動物每周兩次注射含 有⑶40、⑶80和⑶86反義寡核苷酸的微球。另外10只動物注射含有不針對⑶40、⑶80和 /或⑶86的錯義序列的寡核苷酸混合物的微球。對于這兩組動物來說，每次注射都在100 微升注射液的微球中含有50 y g寡核苷酸。錯義組動物中的兩只由于身體狀況差在實驗結 束前被安樂死。在開始進行注射方案后，血糖水平每周取樣兩次。在實驗過程中動物不禁 食。結果在圖12中作圖，其中指示符（1)表示開始用胰島素顆粒，指示符（2)表示除去胰 島素顆粒并開始每周兩次MSP注射。應該注意在圖12中報道的最商血糖值是700mg/dL，這 對應于所用測量計的最大讀數，應該理解為700mg/dL數據點表示血糖讀數為700mg/dL以 上。接受含有⑶40、⑶80和⑶86反義寡核苷酸混合物微球的組中所有的動物（ASMSP1到 ASMSP6)與接受帶有錯義寡核苷酸的微球的動物（SCRMSP1到SCRMSP10)相比，顯示出明顯 較低的葡萄糖水平。此外，該ASMSP組的6只動物中4只顯示出血糖水平低于400mg/dL，這 一般被認為是糖尿病發作的閾指標。
[0077] 在圖13A中顯示了實驗的時間線。對每組的平均非空腹血糖（圖13B)和平均空 腹血糖水平（圖13C)進行了作圖（+/-SEM)。在某些小鼠中，如圖13A所示撤銷了 ASMSP的 施用。如圖13B和13C所示，在新發作糖尿病的N0D雌性小鼠中施用多輪AS-MSP，相對于未 治療動物（對照）、用PBS治療的動物或用錯義寡核苷酸（SCR-MSP)微球治療的動物來說， 改善了血糖水平并產生穩定的空腹血糖正常，即使是在撤去AS-MSP后。
[0078] 圖7c和7d顯示了在糖尿病發作后用反義制劑治療的N0D小鼠的胰腺組織切片， 并顯示了疾病的逆轉。切片用蘇木精和曙紅染色（H+E ;圖7c)或對胰島素染色（圖7d)。
[0079] 三種不同的AS-寡核苷酸可以被結合在PR0MAXX微球中，這樣的微球可以用作組 合物，通過誘導免疫調節性樹突狀細胞預防和/或逆轉新發作的自身免疫糖尿病。事實上， 單次注射組合物延遲了疾病發作，而在新發作糖尿病的小鼠中重復用藥使高血糖歸于正 常，表明了疾病的逆轉。在這些研究中，每日施用胰島素，直到血糖低于300mg/dL。然后在 皮下施用AS-MSP下停用胰島素。在示例性給藥方案中，動物每周兩次施用每公斤體重2mg AS-MSP，為期3-4周。對無糖尿病的NOD小鼠進行監測。
[0080] 在圖14A-C中，證實了給N0D小鼠施用AS-MSP使所述小鼠的血糖水平回復到正常 水平，并且所述血糖水平的正常化維持一段較長的時期。如圖14B和14C所示，在停止施用 胰島素后〇到30天之間施用AS-MSP。在停用胰島素后第15天，血糖水平回復到正常，并保 持正常水平直到監測期結束（第55天）。
[0081] 在圖15中顯示了自身免疫糖尿病的治療性逆轉的影響的圖示。如果P在圖15中 顯示的新發作"蜜月"期施加R0MAXX治療的話，預計將會保留10-20%的仍具有功能的3 細胞，從而導致對糖尿病的控制并減少患者對胰島素的依賴。
[0082] 應該理解，已經描述的本公開的實施方案是說明本公開的原理的某些應用。對于 本領域的專業人員來說，可以在不背離本公開的真實精神和范圍下進行大量的修改。本文 描述的各種特點可以以任何組合使用，而不限于在本文具體概括的明確組合。
【主權項】
1. 含有寡核苷酸的微球在制備用于逆轉哺乳動物1型糖尿病的藥物中的應用，所述哺 乳動物顯示糖尿病癥狀，其中所述寡核苷酸與選自CD40、CD80和CD86初級轉錄物的初級轉 錄物及其組合是反義的并與它們定向結合，其中所述藥物每周施用兩次。2. 權利要求1的應用，其中所述寡核苷酸選自SEQIDNO: 1、SEQIDN0:2或SEQID NO:3及其組合。3. 權利要求1的應用，其中所述藥物使得所述哺乳動物的血糖水平與所述哺乳動物在 施用所述組合物前的血糖水平相比正常化。4. 權利要求1的應用，其中所述微球含有與CD40、CD80和CD86初級轉錄物是反義的 并與它們定向結合的寡核苷酸。5. 權利要求1的應用，其中所述藥物的施用引起所述哺乳動物的P細胞群的再生。6. 權利要求1的應用，其中所述藥物為可注射的組合物。7. 權利要求1的應用，其中所述藥物與胰島素組合施用。8. 權利要求7的應用，其中所述胰島素在所述藥物施用之前、同時或之后施用。9. 權利要求1的應用，其中所述微球的70%w/w或更多是寡核苷酸。10. 權利要求9的應用，其中所述微球藥物中反義⑶40:反義⑶80:反義⑶86的比率 是I:1:1。
【專利摘要】本發明涉及預防和/或逆轉新發作自身免疫糖尿病的基于微球的組合物。具體地，本發明采用微球形式投送AS-寡核苷酸以誘導樹突狀細胞耐受，特別是在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型中。微球結合了反義(AS)寡核苷酸。方法包括使用反義方法在NOD小鼠中體內逆轉自身免疫糖尿病病癥。寡核苷酸被定向結合于初級轉錄物CD40、CD80、CD86以及它們的組合。
【IPC分類】A61K31/711, A61P3/10, A61K48/00, A61K9/16
【公開號】CN105168146
【申請號】
【發明人】拉里·R·布朗, 尼克·吉安努卡基斯, 金伯利·A·吉利斯
【申請人】巴克斯特國際公司, 巴克斯特醫療保健股份有限公司, 高等教育聯邦體系所屬匹茲堡大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2007年8月6日