幼魚肝臟形態正常。ImM和5mM硫代乙酷胺處理組未見崎形和肝臟形 態學改變。IOmM和15mM硫代乙酷胺處理組出現肝臟萎縮、顏色變暗、透光性差，卵黃囊腫， 但同時發育明顯滯后，魚饌完全缺失，屯、包水腫明顯。20mM硫代乙酷胺處理組斑馬魚發育嚴 重崎形，脊柱彎曲，卵黃囊凝結，肝臟嚴重萎縮、變黑，并導致大量斑馬魚死亡（圖10)。 陽11引4.定量分析
[0114] 巧光顯微鏡下拍照記錄斑馬魚肝臟巧光情況。與空白對照組和溶劑對照組相比，ImM和5mM硫代乙酷胺處理組的幼魚肝組織巧光面積無明顯變化，IOmM, 15mM，20mM硫代乙 酷胺處理組的幼魚肝組織巧光面積明顯下降，肝臟明顯萎縮退化（圖11)。
[0115]利用圖像處理軟件計算所述模型的肝臟面積和體面積。根據如下公式計算各組斑 馬魚的肝臟面積指數：
[0116] 肝臟面積指數=肝臟面積/體面積X100%。
[0117]各組斑馬魚肝臟面積指數W靈+S表示，采用獨立樣本t檢驗法分析比較組間差異 的顯著性。
[0118] 統計結果顯示，與空白對照組相比，ImM和5mM的硫代乙酷胺處理組斑馬魚肝臟面 積指數無顯著性變化，IOmM, 15mM，20mM的硫代乙酷胺處理組斑馬魚肝臟面積指數顯著降 低，差異具有顯著統計學意義（P<〇. 01)(圖12)。
[0119] 選用硫代乙酷胺制備的斑馬魚肝臟損傷模型，當給藥濃度小于IOmM時，斑馬魚未 見崎形，肝臟形態、肝臟面積指數也未發生顯著性變化，未造成斑馬魚肝臟損傷。當給藥濃 度大于IOmM時，斑馬魚肝臟萎縮、肝臟面積指數顯著降低，斑馬魚出現肝臟損傷，但同時觀 察到斑馬魚屯、包嚴重水腫、脊柱彎曲、發育滯后。與硫代乙酷胺相比，10 的甲糞威可明顯 降低斑馬魚肝臟指數，造成斑馬魚肝臟損傷，但對其他臟器毒性較小，未出現斑馬魚嚴重水 月中、脊柱彎曲、發育滯后等毒性。因此選用甲糞威建立斑馬魚肝損傷模型，利用肝臟面積指 數變化作為檢測肝臟功能的指標，分析待測化合物是否具有保護或改善肝功能活性，更加 科學、客觀。
[0120] 結果分析 陽121] 由上述實施例和對比例的結果可W看出，本發明所述的模型相對已報道的保肝藥 物篩選模型有W下優點：（1)首次利用甲糞威建立斑馬魚肝功能損傷模型。與目前常用的 肝損傷藥物如四氯化碳、硫代乙酷胺等相比，甲糞威毒性較低，無體內積累作用。（2)甲糞威 是直接加入養魚水中，相對灌胃法或腹腔注射的方法操作較簡便。（3)甲糞威誘導斑馬魚肝 損傷的時間相對較短，有效的縮短了實驗周期。（4)采用肝臟特異表達巧光的斑馬魚，可在 巧光顯微鏡下直接觀察化合物對斑馬魚肝臟形態、大小的影響。（5)首次將肝臟面積指數作 為斑馬魚肝功能評價的檢測指標。
[0122] 肝臟是魚類中間代謝的主要器官和營養儲存場所，當生存條件發生變動時，肝臟 會相應的發生顯著變化，而魚體變化較緩，因此肝臟面積指數不僅可W去除個體差異的影 響，又可快速、定量評價化合物對斑馬魚肝臟損傷的修復作用，更加科學、客觀，提高了結果 的準確性，適用于保護或改善肝功能活性化合物的高通量篩選。
【主權項】
1. 一種斑馬魚肝功能損傷模型的制備方法，其特征在于，步驟如下： 將受精后2~3天發育正常的斑馬魚置于含有甲萘威濃度為5~30yM的培養水溶液 中，26~30°C下恒溫培養24~72小時，制得斑馬魚肝功能損傷模型。2. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的培養水溶液包括如下組分： NaCl5mM，KCl0? 17mM，CaCl2O. 4mM，MgSO4O. 16mM，去離子水配制。3. 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述培養水溶液還包括體積濃度不大 于0. 5%的二甲基亞楓。4. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，甲萘威濃度為10yM。5. -種篩選具有保護斑馬魚肝功能活性化合物的方法，其特征在于，步驟如下： (1) 將受精后3天的發育正常的斑馬魚置于含有甲萘威濃度為5~30yM的培養水溶 液中，培養24~72小時，制得肝損傷組斑馬魚；將發育3天的斑馬魚置于含有甲萘威濃度 為5~30yM、待測化合物濃度為0.IyM~1000yM的培養水溶液中，培養24~72小時， 制得治療組斑馬魚；將發育3天的斑馬魚采用培養水在相同條件下培養24~72小時，制得 正常組斑馬魚； 或者，將受精后3天的發育正常的斑馬魚，置于含有甲萘威濃度為5~30yM的培養水 溶液中，培養20~28小時，去除死亡斑馬魚，用純水洗凈斑馬魚表面殘留液，然后將斑馬魚 分為兩組，一組移入培養水中，另一組移入含有待測化合物的培養水溶液中，將兩組斑馬魚 繼續培養24~48小時，培養水培養的一組為肝損傷組斑馬魚，含有待測化合物的培養水溶 液培養的一組為治療組斑馬魚；將發育3天的斑馬魚采用培養水在相同條件下培養斑馬魚 44~76小時，制得正常組斑馬魚； (2) 觀察步驟（1)制得的正常組斑馬魚、肝損傷組斑馬魚、治療組斑馬魚，記錄并計算 斑馬魚肝臟面積和斑馬魚體面積，按照如下公式計算肝臟面積指數： 肝臟面積指數=肝臟面積/體面積X100% ; (3) 當肝損傷組斑馬魚的肝臟面積指數超出正常組斑馬魚的肝臟面積指數范圍，且達 到統計學上的顯著性水平（P〈〇. 05)，則成功造成斑馬魚肝臟功能損傷模型；在斑馬魚肝臟 功能發生損傷前提下，當治療組斑馬魚的肝臟面積指數高于肝損傷組，且達到統計學上的 顯著性水平（P〈〇. 05)，則待測化合物具有保護或改善肝臟功能的活性； 所述的正常斑馬魚的肝臟面積指數為： 受精后4d的斑馬魚肝臟面積指數為1. 99~2. 66 %，受精后5d的斑馬魚肝臟面積指數 為3. 07~3. 82%，受精后6d的斑馬魚肝臟面積指數為3. 93~4. 84%，受精后的7d斑馬 魚肝臟面積指數為3. 25~4. 39%。6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述斑馬魚胚胎為肝臟特異表達熒光的斑 馬魚胚胎。7. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中的培養，溫度為26~30°C， 光照培養，每天更換培養水或培養水溶液； 優選的，所述步驟（1)中，正常組斑馬魚、肝損傷組斑馬魚、治療組斑馬魚均至少做三 組平行實驗，每組斑馬魚總數不低于15枚；進一步優選的，每組斑馬魚總數為30~50枚； 優選的，所述步驟（1)中，甲萘威濃度為10yM。8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述培養液組分如下： NaCl5mM，KCl0? 17mM，CaCl2O. 4mM，MgSO4O. 16mM，去離子水配制。9. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)還包括觀察前的預處理步驟： 將需要觀察的斑馬魚胚胎用質量濃度為〇. 3%。的三卡因浸泡40~90s進行麻醉，然后用 3%甲基纖維素固定于載玻片上。10. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)的觀察為在熒光顯微鏡下觀 察； 優選的，所述步驟（2)的記錄為拍照記錄； 優選的，所述步驟（2)的計算為利用圖像處理軟件計算。
【專利摘要】本發明涉及一種篩選具有保護斑馬魚肝功能活性化合物的方法。該方法將能造成肝損傷的甲萘威與待測化合物共同作用于斑馬魚，或者先用甲萘威作用于斑馬魚造成肝臟損傷然后再用待測化合物處理損傷后的斑馬魚，利用肝臟面積指數變化作為檢測肝臟功能的指標，分析待測化合物是否具有保護或改善肝功能活性。本發明首次利用甲萘威建立斑馬魚肝功能損傷模型，建立的斑馬魚肝功能損傷模型具有制作簡單、快速、穩定可靠和重復性好的優點，降低了肝功能損傷模型的制作成本，提高了實驗研究結果的可靠性。
【IPC分類】A61K49/00, A61K31/222
【公開號】CN105169415
【申請號】
【發明人】張云, 劉可春, 韓利文, 何秋霞, 王雪, 彭維兵, 陳維云, 王希敏, 侯海榮, 陳錫強
【申請人】山東省科學院生物研究所
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年8月10日