活性均 >97 %。
[0145] 胎盤底蛻膜間充質干細胞的細胞周期TOB-MSCsGo/Gi期占90.6%，G2/M期占3.4%， 3期占5.9%。
[0146] 說明：胎盤底蛻膜存在能穩定增殖的干細胞。不表達造血細胞與移植排斥相關的 細胞表面標記，提示從底蛻膜來源的基質細胞是MSCs，具有干細胞的特性屬于免疫缺陷細 胞，適宜于不同個體之間的臨床回輸移植治療。經鑒定以及本發明的培養體系結果表明本 分離培養所獲得的細胞為TOB-MSCs，其具有極強增殖能力和多向分化潛能，是細胞臨床回 輸移植治療以及組織工程具有前景的種子干細胞，細胞純度較高。在提升目標PDB-MSCs純 度，可重復進行干細胞具體實施方法3步驟來獲得更高純度的TOB-MSCs細胞。
[0147] 八、本發明的具有以下優點：
[0148] 本發明公開了人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞(PDB-MSCs)的培養、篩選、擴 增儲存技術，這些瓶頸一直是生物學干細胞領域研究的熱點和難點，目前利用基底膜顯著 黏附特性進行分離純化，采用三維培養擴增手段來獲得。
[0149] 該發明適合依賴擴增貼壁型細胞并提供三維空間架構高擬體內細胞外基質系統 進行目標細胞水平的篩選與分離。
[0150] 本發明屬于高模擬體內貼附環境，體外培養TOB-MSCs干細胞的生物細胞新型培養 技術。其特征在于:細胞基質底物為供體脫細胞胎盤組織，去羊膜胎盤組織與人胎盤底蛻膜 層為基質底物篩選最佳黏附場所篩選干細胞的制備方法;相應roB-MSCs高模擬底物所在環 境黏附篩選培養目標干細胞。用該方法取得的roB-MSCs干細胞，具有高傳代能力，高增殖能 力，并可在體外環境下形成誘導成脂誘、成骨誘、成軟骨分化。此方法比傳統意義上的PDB-MSCs干細胞篩選更具科研與教學臨床應用意義深入研究干細胞生長增殖分化提供了不可 估量的科研學術價值，開創體外高擬體內貼壁附著培養的新紀元，此方法提出為國內國際 首創。
[0151 ]通過這種高目標模式的篩選，結合組織工程低免疫性安全性，延長移植時間增加 細胞治療臨床疾病提供了絕對優勢的解決方案。
[0152] 1、胎盤組織高擬體內細胞外基質，基質附著體外篩選方法對種子TOB-MSCs干細胞 進行篩選與于體內的微環境一致性是目前任何方法不可取代的，并且制備簡單可反復使 用；
[0153] 2、特異性強，通過免疫組化檢測、透射電鏡觀察及流式細胞儀檢測，結果表明本發 明的TOB-MSCs干細胞純度高；
[0154] 3、PDB_MSCs干細胞科研價值:干細胞細胞譜系的研究，深入探討研究干細胞黏附， 生長、增殖、分化、免疫表達等學科基礎研究；
[0155] 4、該方法可為其它器官體細胞外培養再生提供良好的科研理論基礎；
[0156] 5、再生醫學組織工程領域應用種子H)B-MSCs干細胞庫。
【附圖說明】
[0157] 圖1是本發明胎盤組織高擬體內細胞外基質的制備流程。
[0158] 圖2是本發明的TOB-MSCs應用胎盤組織高擬體內細胞外基質篩選培養方法流程。
【主權項】
1. 一種臨床治療級人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞(PDB-MSCs)制備方法，由以下 步驟組成；（1 )PDB-MSCs培養液組合；（2)篩選用胎盤組織高擬體內細胞外基質制備；（3)應 用胎盤組織高擬體內細胞外基質與H)B-MSC S培養液組合篩選培養TOB-MSCs，以及TOB-MSCs 長期凍融保存液制備。2. -種利用權利要求1所述的PDB-MSCs培養液組合包括： 配制培養液A:人胎盤脂多糖注射液0.03ml/L、EGF5~25ng/ml、干細胞生長因子(SCF)2 ~llng/ml、轉鐵蛋白5~15μg/ml、維生素 Μ 0· 5~lmg/L、維生素 Cl~4μg/ml、胰島素5~8μ g/ml、青霉素50~100u/ml、鏈霉素100u/mL、氫化可的松0.4μg/ml、商用培養基-低糖DMEM/ 卩12(3:1)定容到50〇1111。？田空制在7.2~7.4 ; 配制培養液B:人胎盤脂多糖注射液0.05ml/L、人血清白蛋白（HSA)l~3g/L、人血纖粘 蛋白（FN)1~5yg/L、人層粘連蛋白（LN)5~10yg/L、血小板衍生因子(H)GF)1~10mg/L、胎盤 生長因子(rhPIGF)l~6mg/L、血管內皮細胞生長因子(VEGF)l~6yg/L、EGF5~10ng/ml、維 生素 B1~5mg/L、葉酸1~10ng/ml、維生素 E 0.05~lmg/L、維生素 Μ 0 · 5~lmg/L、黃體酮 0.01 ~0.04yg/L、輔酶Q10 0· 1 ~2mM/L、膽固醇 1 ~10mg/L、牛橫酸0· 1 ~0.4g/L、肝素納0· 1 ~0.3g/L、胰島素5~6μg/ml、青霉素100u/ml、鏈霉素100u/mL、商用培養基低糖DMEM與商用 培養基F12( 1:1)定容到500ml 控制在7.2~7.4; 配制培養液C:人胎盤脂多糖注射液0.01~0.3ml/L、人血清白蛋白（HSA)0.1~6g/L、人 血纖粘蛋白（FN)3~25yg/L、人層粘連蛋白（LN)10~60yg/L、重組人胰島素樣生長因子-1 (IGF-1) 1~4mg/L、血小板衍生因子(PDGF) 10~20mg/L、胎盤生長因子(rhPIGF) 6~10mg/L、 血管內皮細胞生長因子(VEGF)6~10yg/L、重組人肝細胞生長因子(HGF)5~20mg/L、EGF、 bFGFlO~25mg/L、重組人腦源性神經營養因子(BDNF)15~40ng/ml、維生素 B1~4mg/L、葉酸 1 ~15ng/ml、黃體酮0 · 01 ~0 · 06yg/L、維生素 E0 · 05~1 · 2mg/L、維生素 C 0 · 1 ~10mg/L、維生 素 B4 0· 1~0.5mg/L、輔酶Q10 0· 1~2mM/L、膽固醇1~10mg/L、牛磺酸0· 1~0.4g/L、肝素鈉 0 · 1~0 · 3g/L、還原性谷胱甘肽3~6yg/L、油酸0 · 5~7 · 5mg/L、轉鐵蛋白6~20mg/L、胰島素5 ~7mg/L、多聚賴氨酸4~6mg/L、青霉素100u/ml、鏈霉素100u/mL、商用培養基低糖DMEM與商 用培養基F12( 1:1)定容到500ml 控制在7.2~7.4。3. -種利用權利要求1所述篩用胎盤組織高擬體內細胞外基質制備方法，包括 其中所述的胎盤組織高擬體內細胞外基質分為三種：1.1人胎盤底蛻膜層作為細胞外 基質；1.2去羊膜胎盤組織作為細胞外基質；1.3胎盤組織作為細胞外基質； 制備包括以下步驟:A)胎盤組織消毒處理;B)高擬體內細胞外基質脫細胞處理;C)將消 毒或經脫細胞處理的高擬體內細胞外基質進一步進行低溫、脫水、輻照滅菌處理;其中所述 步驟B)的脫細胞方法選自冷酶交聯劑法、酶一非離子表面活性劑一絡合劑聯合法、絡合劑 加鹽-陰離子表面活性劑法或胰酶聯合Η)ΤΑ交聯液法。4. 如權利要求3所述的B)胎盤組織高擬體內細胞外基質脫細胞處理步驟，其特征在于， 所述的胎盤高擬體內細胞外基質的制備方法中的冷酶交聯劑法是:加入〇. 1~〇. 5 %蛋白酶 冰浴冷消48~12h，用含0.25 %戊二醛磷酸緩沖溶液，pH在7.20~7.40之間，交聯4~6h，超 純水或注射用水沖洗8~10次； 所述的制備方法中的酶一非離子表面活性劑一絡合劑聯合法是:0.1~0.25%中性蛋 白酶與0.01~0.02%EDTA，0.1~0.8%TritonX -100溶液，室溫下作用48~24h; 所述的絡合劑加鹽-陰離子表面活性劑法是:ο. 01~ο. 〇2%EDTA含0.1~lmol/L氯化鈉 溶液，37 °C下作用24~12h，后用0.1~0.8 % SDS溶液，室溫下作用60~30min; 所述的胰酶聯合EDTA交聯液是:0.1~0.6 %胰蛋白酶和0.01~0.1 % EDTA，胰蛋白酶與 EDTA溶液按照體積比為1:2配比，37 °C快速消化60~1 Omin，交聯液中交聯4~6h，交聯后用 超純水或注射用水沖洗8~10次。5. 如權利要求3所述的C)步驟低溫、脫水、輻照滅菌，其特征在于，低溫一30~一 100°C 冷凍干燥，真空度達到10~130pa，脫去臍帶組織高擬體內細胞外基質90~95 %以上水分， 取出密封與真空包裝，經輻照15~80KGY劑量滅菌。6. -種利用權利要求1所述的應用胎盤組織高擬體內細胞外基質與PDB-MSCs培養液組 合篩選培養H)B-MSCs的方法，包括： a) 制備PDB-MSCs懸液:取材，消化液A，B或C二步消化，用權利要求2所述的含10 %人血 清培養液A終止消化，過濾GE Ficol 1分離液，收集細胞層，重懸細胞計數，后加入培養液A; b) PDB-MSCs的篩選及培養:將胎盤高擬體內細胞外基質加入權利要求2所述的培養液 B，加入步驟a)制備的細胞懸液，培養，清洗，目標PDB-MSCs貼壁粘附于胎盤高擬體內細胞外 基質，加入權利要求2所述的培養液C進行擴增培養； c) 消化富集傳代培養：消化液B或C消化，含10 %人血清培養液B終止消化，離心后加入 權利要求2所述的培養液C進行擴增培養； d) PDB-MSCs長期凍融保存液制備。7. -種利用權利要求6所述的消化液A、B、C，其特征在于，組分包括： 消化液配制A:含溶質0.1 %中性蛋白酶和0.1 % Π 型膠原酶(體積比1:1 )，無菌含雙抗 PBS為溶劑，配制溶液。 消化液配制B:含溶質0.8%IV型膠原酶和0.1% Π 型膠原酶(體積比1:1)，無人胎盤脂 多糖注射液培養液A為溶劑，配制溶液。 消化液配制C:含溶質0.1 %中性蛋白酶和0.5% IV型膠原酶與0.1 % Π 型膠原酶(體積 比1:1:1 )，無人胎盤脂多糖注射液培養液A為溶劑，配制溶液。8. -種利用權利要求1所述的TOB-MSCs凍融保存液制備，其特征在于，抗凍溶質組分包 括:維生素 Μ 1~10μg/ml，維生素 C 1~4μg/ml，聚乙二醇4ml、（優選自體血清)人AB血清10 ~15%、甘油20%、甘露醇3ml、細胞松弛素2.7μg/ml、二甲基亞砜(DMSO)IO%、硫酸軟骨素3 ~6 %，保存配制液以權利要求2所訴無抗的培養液ABC為溶劑制備抗凍溶液，0.22μπι微孔濾 過除菌。
【專利摘要】本發明屬于生物干細胞醫學醫藥領域，特別公開發明了一種臨床治療級人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞(PDB-MSCs)的高擬體內貼附環境細胞外基質附著體外提取制備方法，發明特征包括體外分離及規模化培養擴增及保存的方法。通過高擬體外細胞外基質附著鎖定目標PDB-MSCs貼附培養，利用優選的仿生體內環境培養基組合，梯度降無清馴化培養體系獲得臨床治療級別的PDB-MSCs干細胞一種科學快速有效獲取創新方法。本發明獲得干細胞國際細胞協會(ISCT)標準具有高純度、干細胞增殖擴增、傳代活性強、以及凍存保護細胞活性技術，該技術應用是干細胞治療領域核心基礎，滿足了PDB-MSCs干細胞臨床藥物設計開發與醫療機構開展干細胞療法回輸安全有效應用的需求。
【IPC分類】C12N5/0775, C12N5/073, A01N1/02
【公開號】CN105647860
【申請號】
【發明人】王凌儀, 陳玲, 李小珍, 沈境, 張穎, 徐琴, 李磊, 周燕婷, 劉燕, 劉耀文, 譚澤文
【申請人】王凌儀
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月30日