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【發明內容】
[0058] 一、胎盤組織高擬體內細胞外基質種類：
[0059] 1.1其特征在于:針對本發明技術的發展現狀，本發明的目的是提供一種高擬體內 人胎盤底蛻膜層作為細胞外基質為篩選貼附，間充質干細胞篩選分離和體外培養的方法， 并使獲得的高純度間充質干細胞。
[0060] 1.2其特征在于:針對本發明技術的發展現狀，本發明的目的是提供一種高擬體內 去羊膜胎盤組織(保留絨毛層與底蛻膜層)作為細胞外基質為篩選貼附，間充質干細胞篩選 分離和體外培養的方法，并使獲得的高純度間充質干細胞。
[0061] 1.3其特征在于:針對本發明技術的發展現狀，本發明的目的是提供一種高擬體內 胎盤組織作為細胞外基質為篩選貼附，間充質干細胞篩選分離和體外培養的方法，并使獲 得的高純度間充質干細胞。
[0062] 發明屬生物成體(胎兒)干細胞細胞技術領域，方法特征包括:人胎盤底蛻膜層脫 細胞底物預備;間充質干細胞的分離;利用高擬體內附著基質間充質干細胞的篩選及培養。 [0063]目前用該法在體外已穩定培養傳代超過11(代），經檢測發現擴增11代前的間充質 干細胞仍具有正常的染色體組型，無異常改變。經體內外實驗證實該細胞無細胞毒，具有較 強的增殖能力，并可以形成分化，間充質干細胞在科研、教學及臨床的應用起到不可估量的 作用，同時孕育著巨大學術方向與社會效益和經濟效益。通過此種方法的理論基礎推進了 我國間充質干細胞的學術基礎建立。
[0064] 二、胎盤組織高擬體內細胞外基質構成：
[0065] 含有多種膠原其中包含I、n、m、IV型、型膠原。保留了天然三維孔隙結構。
[0066] 三、胎盤組織高擬體內細胞外基質底物孔隙率與黏附表面特征：
[0067]高擬底物電鏡觀察，測定該種黏附的底物組織再生的基底膜孔隙直徑為32~200μ m。這種孔隙率所構建的三維空間黏附表面均有利于間充質干細胞黏附附著生長、增殖、分 化。
[0068] 通過以上制備方法;有效的保留了細胞外基質的微觀構架和完整的基底|旲結構， 其主要成分包括各型膠原、彈性蛋白、蛋白多糖及糖胺多糖等不溶性基質成分，可為間充質 干細胞快速粘附、增殖擴展提供有力的支持。因此，胎盤高擬底物是目前最理想的細胞篩選 的解決方案。
[0069] 四、胎盤組織細胞高擬體內細胞外基質制備具體實施步驟與方法：
[0070] 一、包括以下兩個步驟種方法：
[0071] 步驟一:胎盤組織消毒處理過程：
[0072] 胎盤組織高擬體內細胞外基質種類1.1處理過程:取供體手術臺無菌條件獲取健 康足月產嬰兒胎盤組織，4°c保存，在生理鹽水稀釋含0.05~0.1 %苯扎溴銨溶液中10~ 15min，充分清洗殘留的血液，漂洗消毒處理至無色，在超凈工作臺內取出胎盤組織，剝除羊 膜，胎盤高擬體內細胞外基質種類1.1進一步剝離絨毛層，保留底蛻膜層組織，剪切成組織 塊浸泡，用無菌生理鹽水反復沖洗殘余苯扎溴銨。
[0073] 胎盤高擬體內細胞外基質種類1.2處理過程:取供體手術臺無菌條件獲取健康足 月產嬰兒胎盤組織，4°C保存，在生理鹽水稀釋含0.05~0.1 %苯扎溴銨溶液中10~15min， 充分清洗殘留的血液，漂洗消毒處理至無色，在超凈工作臺內取出胎盤組織，剝除羊膜，保 留絨毛層與底蛻膜層組織，剪切成組織塊浸泡，用無菌生理鹽水反復沖洗殘余苯扎溴銨。
[0074]胎盤高擬體內細胞外基質種類1.3處理過程:取供體手術臺無菌條件獲取健康足 月產嬰兒胎盤組織，4°C保存，在生理鹽水稀釋含0.05~0.1 %苯扎溴銨溶液中10~15min， 充分清洗殘留的血液，漂洗消毒處理至無色，在超凈工作臺內取出胎盤組織，剪切成組織塊 浸泡，用無菌生理鹽水反復沖洗殘余苯扎溴銨。
[0075] 步驟二:低溫一 30~一 100 °C冷凍干燥，真空度達到10~130pa，脫去胎盤組織塊90 ~95 %以上水分，取出密封與真空包裝，經輻照15~80KGY劑量滅菌。終品可以長期保存。啟 動只需浸泡37°C，PBS液或下面所述營養液復蘇15~30min即可應用，浸泡延長至10~12h效 果更佳。使用后并且應用去細胞漂洗液(見下方法中相應提及適合的脫細胞液)脫細胞處 理、再經過上述過程永生反復使用的特點。
[0076] 1:步驟二【具體實施方式】：
[0077]
[0078]
[0079] 上述所提及的脫細胞液制備如下所述：
[0080] 二、方法：
[0081] 實例方法1:組織器官經處理后加入0.1~0.5%蛋白酶冰浴冷消48~12h。用含 0.25 %戊二醛磷酸緩沖溶液調節PH在7.20~7.40之間用交聯液沖洗組織塊3~6次，最后放 入交聯液中交聯4~6h，結束后用超純水(或注射用水)反復沖洗8~10次去除殘留戊二醛， 即可進行冷凍干燥脫水封裝。
[0082] 1.1:實例方法1【具體實施方式】：
[0083]
[0084] 方法一特點：交聯劑可有效的使結締組織蛋白不可溶性的交聯構架，增強底物的 抗降解性，保持底物完整，蛋白酶處理底物可使其柔任性增強。
[0085] 獲得的基底細胞層是細胞最為活躍的附著、分裂、分化場所，組織層空間架構在體 外支架材料很難模擬模仿。故此類胎盤組織高擬體內細胞外基質是最適合間充質干細胞粘 附、增殖、生長、分化所需的理想微環境場所。
[0086] 實例方法2:酶一非離子表面活性劑一絡合劑聯合法
[0087] 0.1~0.25%DisPase中性蛋白酶與0.01~0.02%EDTA聯合消化，中性蛋白酶作用 于基底膜，選擇性地分解纖維連接素與IV型膠原(4°C下作用48h)，然后應用非離子型表面 活性劑使細胞溶解破壞TritonX -100(聚乙二醇辛基苯基醚）（0.1~0.8%溶液，室溫下作 用48~24h)與生物膜中的磷脂等脂質結合形成復合物溶解于溶液中，同時TritonX -100中 的親油基端也能和細胞外膜蛋白結合破壞生物膜，從而達到脫棄細胞作用。
[0088] 脫細胞后經方法1進行戊二醛交聯步驟，即可進行冷凍干燥脫水封裝。
[0089] 2.1:實例方法2【具體實施方式】：
[0090] L0091J 買例萬法3:絡合刑加鹽-陰離于表?
沽性刑法
[0092] 利用高滲氯化鈉溶液（（0.01~0.02% EDTA含0.1~lmo 1/L氯化鈉溶液，37 °C下作 用24~12h))使錨狀細絲與組織基底細胞的半橋粒分離開來，從而完整去除細胞，再用破膜 劑十二烷基磺酸鈉(〇. 1~〇. 8 % SDS溶