液，室溫下作用60~30min)將細胞成分從胎盤組織中 去除。
[0093]脫細胞后經方法1進行戊二醛交聯步驟，即可進行冷凍干燥脫水封裝。
[0094] 3.1:實例方法3【具體實施方式】：
[0095]
[0096] 實例方法4:用0.1~0.6 %胰蛋白酶和0.01~0.1 % EDTA體積比（1: 2)混合液聯合 消化組織塊，37°C，快速消化60~lOmin，反復漂洗脫細胞，最后放入交聯液中交聯4~6h，結 束后用超純水(或注射用水)反復沖洗8~10次去除殘留戊二醛，即可進行冷凍干燥脫水封 裝。
[0097] 4.1:實例方法4【具體實施方式】：
[0098]
[0099] 以上方法均可組合制備出高擬體內細胞外基質所述：1.1、1.2、1.3進行篩選間充 質干細胞。
[0100] 上述方法制得略有差異，時間上成本上有異、但均可有效使得細胞成分被清除，基 質的結構完整性被保留，含有彈力素、硫酸角質素、層粘素、各型膠原、纖維連接素、結合素、 基底膜結構成分均可以完整保留。
[0101] 對于附著性的種子間充質干細胞提供了有利微環境，使其表達、生長、增殖、分化 等起到極其重要作用，常規篩選方法不可替代高模擬附著狀態三維空間架構，我們稱之為 "細胞種植黑土壤環境"。
[0102] 胎盤組織高擬體內細胞外基質篩選人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞培養法
[0103] 五、人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞取材篩選：
[0104] 從手術臺無菌條件下取健康足月產嬰兒胎盤組織置于培養液A中，4°C保存。在超 凈工作臺內取出胎盤，剝除羊膜，剝離絨毛層組織，取底蛻膜層胎盤組織，用PBS緩沖液充分 清洗殘留的血液，反復沖洗漂洗至無色，沖洗干凈無血跡后用剪刀剪取胎盤蛻膜層組織1~ 2cm厚的組織剪成的碎片。
[0105] 人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞取材篩選步驟中的胎盤蛻膜層組織塊。
[0106] 六、人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞篩選培養步驟
[0107] 因為人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞對基底膜有較強的粘附性，對細胞外基 質的粘附速度要比其它類型細胞快得多，所以利用該種特性進行培養篩選。
[0108] 七、人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞篩選培養權利要求方法：
[0109] 1、培養液制備：
[0110] 配制培養液A:人胎盤脂多糖注射液0.03ml/L、EGF5~25ng/ml、干細胞生長因子 (SCF)2~llng/ml、轉鐵蛋白5~15μg/ml、維生素 B4 0 · 5~lmg/L、維生素 C1~4μg/ml、胰島 素 5~8μg/ml、青霉素 50~100u/ml、鏈霉素 100u/mL、氫化可的松0.4μg/ml、商用培養基-低 糖 DMEM/F12( 3:1)定容到500ml JH 控制在7.2~7.4。
[0111] A.1:配制培養液A【具體實施方式】
[0112]
[0113] 配制培養液B:人胎盤脂多糖注射液0.05ml/L、人血清白蛋白（HSA) 1~3g/L、人血 纖粘蛋白（FN) 1~5yg/L、人層粘連蛋白（LN) 5~1 Oyg/L、血小板衍生因子(PDGF) 1~1 Omg/L、 胎盤生長因子（rhPIGF)l~6mg/L、血管內皮細胞生長因子(VEGF)l~6yg/L、EGF5~10ng/ ml、維生素 B1~5mg/L、葉酸1~10ng/ml、維生素 E 0 · 05~lmg/L、維生素 Μ 0 · 5~lmg/L、黃 體酬0.01~0.04yg/L、輔酶Q10 0 · 1~2mM/L、膽固醇1~10mg/L、牛橫酸0 · 1~0.4g/L、肝素 鈉0.1~0.3g/L、胰島素5~6μg/ml、青霉素100u/ml、鏈霉素100u/mL、商用培養基低糖DMEM 與商用培養基？12(1:1)定容到50〇1111。？田空制在7.2~7.4。
[0114] B.1:配制培養液B【具體實施方式】
[0115]
L0117J 配制培養液C:人胎盤脂多糖注射液0.01~0.3ml/L、人血清白蚩白（HSA)O.l~6g/ L、人血纖粘蛋白（FN)3~25yg/L、人層粘連蛋白（LN)10~60yg/L、重組人胰島素樣生長因 子-1(IGF-1)1~4mg/L、血小板衍生因子（PDGF)IO~20mg/L、胎盤生長因子（rhPIGF)6~ 10mg/L、血管內皮細胞生長因子(VEGF)6~10yg/L、重組人肝細胞生長因子(HGF)5~20mg/ L、EGF、bFGF10~25mg/L、重組人腦源性神經營養因子(BDNF)15~40ng/ml、維生素 B1~4mg/ L、葉酸1~15ng/ml、黃體酮0.01~0.06yg/L、維生素 E 0.05~1.2mg/L、維生素 C 0· 1~ 10mg/L、維生素 B4 Ο · 1~Ο · 5mg/L、輔酶Q10 Ο · 1~2mM/L、膽固醇1~10mg/L、牛橫酸Ο · 1~ Ο · 4g/L、肝素鈉 Ο · 1~Ο · 3g/L、還原性谷胱甘肽3~6yg/L、油酸Ο · 5~7 · 5mg/L、轉鐵蛋白6~ 20mg/L、胰島素5~7mg/L、多聚賴氨酸4~6mg/L、青霉素100u/ml、鏈霉素100u/mL、商用培養 基低糖DMEM與商用培養基F12( 1:1)定容到500ml 控制在7.2~7.4。
[0118] C.1:配制培養液C【具體實施方式】
[0119]
[0
[0121]臨床細胞治療回輸階段細胞擴增。相應進行遞減性馴化培養相應降低或剔除以上 所述配方中的有藥理藥效作用的添加物質。
[0122] 2、消化液配制法：
[0123] 消化液配制A:含溶質0.1 %中性蛋白酶和0.1 % Π 型膠原酶(體積比1:1 )，無菌含 雙抗PBS為溶劑，配制溶液。
[0124] 消化液配制B:含溶質0.8% IV型膠原酶和0.1 % Π 型膠原酶(體積比1:1)，無人胎 盤脂多糖注射液培養液A為溶劑，配制溶液。
[0125] 消化液配制C:含溶質0.1 %中性蛋白酶和0.5 % IV型膠原酶與0.1 % Π 型膠原酶 (體積比1:1:1)，無人胎盤脂多糖注射液培養液A為溶劑，配制溶液。
[0126] 3、篩選人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞凍融保存液制備：
[0127] 抗凍溶質組分包括：維生素 Μ 1~10μg/ml，維生素 C 1~4μg/ml，聚乙二醇4ml、 (優選自體血清)人AB血清10~15 %、甘油20 %、甘露醇3ml、細胞松弛素2.7μg/ml、二甲基亞 砜(DMS0) 10%、硫酸軟骨素3~6%，保存液以配制培養液ABC為溶劑制備抗凍溶液。PH控制 在7.3~7.4，0.22μηι微孔濾過除菌。
[0128] 3.1:3篩選細胞凍融保存液制備【具體實施方式】：
[0129]
[0131]說明，其特征在于:該冷凍液可以通過冷凍長期保存人胎盤底蛻膜層來源的間充 質干細胞活性。
[0132] 5、人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞篩選步驟方法：
[0133] 步驟1、取人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞取材篩選步驟中的胎盤蛻膜層組 織塊，用無菌（青霉素80~100u/ml和80~100μg/ml鏈霉素)PBS充分浸泡3~5min，以roS沖 洗3次，以消化液A常溫消化10~15 m i η，組織塊懸液離心(90 0r / m i η離心5~10 m i η )，棄去消 化液A，收集組織塊與細胞沉淀，在以消化液Β或C(37°C，振蕩120r/min條件下消化30min~ 60min)，用數倍含10 %自體血清或人AB血清培養液A洗滌終止消化，充分均勻吹打后過直徑 100μπι的鋼制篩網過濾，然后將過濾得到的細胞懸液離心(900r/min離心5~lOmin)，棄上清 液，收集細胞沉淀，用等量PBS稀釋后移入預先置有GE Ficoll淋巴細胞分離液的離心管中， 1200~2500r/min離心10~30min，吸取界面云霧狀白膜層控溫在18~20°C，PBS洗滌2~3 次，收集離心獲得的干細胞，再用適量培養液A重懸細胞，計數板計數后調整細胞濃度，以 3xl0 4/ml〇
[0134] 步驟2、取胎盤組織高擬體內細胞外基質選1.1、也可選1.2、1.3，用含抗生素的roS 沖洗3次，再用配制培養液A沖洗3次，于37°C，浸泡在培養液A中復蘇10~12h備用。
[0135] 步驟3、人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞的篩選及培養:取預備好的1.1放入 100mm平皿加入配制培養液B，加入細胞濃度3 X 104/ml脂肪干細胞懸液，37 °C，氣相5 %⑶2 培養箱培養6~72h取出，取出轉移1.1 JBS或培養液B清洗3~6次，目標人胎盤底蛻膜層來 源的間充質干細胞貼壁粘附于1.1上。換皿加入配制培養液C培養，隔6~72h后更換全部培 養基C，此后每2~3d換液一次繼續擴增培養。
[0136] 步驟4、消化富集傳代培養:上述人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞經擴增后， 間充質干細胞生長至80%~90%融合時，加入消化液配制B或C消化1.1，37°C消化15~ 30min，用數倍含10%自體血清或人AB血清培養液B終止消化;稍加吹打，過濾收集細胞懸液 轉移到離心管，600~1200r/min離心4~6min，棄上清液，加入配制的培養液C，重懸細胞，以 1~3 X 106/ml的密度轉移傳代按照上述步驟培養，置37 °C、氣相5 % C02培養箱培養，每3~4d 換配制培養液C 一次繼續擴增培養。
[0137] 6、人胎盤底蛻膜層來源的間充質干細胞生物學特性及免疫組織化學法檢：
[0138] PDB-MSCs細胞形態:人胎盤底蛻膜來源的間充質干細胞TOB-MSCs在該方法培養體 系中能快速增殖，傳代后3~6d能擴增5~6倍，目前以傳代培養11代以上，增殖速度無明顯 下降，倒置顯微鏡觀察3代的細胞形態，細胞形態均呈長梭形纖維樣，與骨髓MSCs相似。
[0139] 免疫組織化學表型：選取3代細胞利用流式細胞儀檢測細胞表面標記，研究發現 PDB-MSCs相關間充質干細胞表面標記CD29是識別整合素亞單位的蛋白、CD44是目前所發現 的成體干細胞最廣泛表達的分布在胞膜和胞漿標志物，該陽性表達進一步證明干細胞的身 份⑶44、CD73、⑶90與⑶105間充質干細胞的特異性表型，均呈高表達陽性，陽性表達均大于 95.2~98.7%。同造血細胞相關的細胞表面標記0)14丄019、0)31丄034、0)45陰性，同時陰 性表達HLA-DR。
[0140] 分化潛能：
[0141] PDB-MSCs成脂誘導連續培養4d，鏡下可見細胞立體感增強內有微小脂滴出現，月旨 滴1~2周后逐漸增大融合，形態為橢圓形或多邊形，油紅0染色法顯示染紅的脂質沉淀。
[0142] PDB-MSCs成骨誘導后培養8d，胞質內細胞顆粒量增加，形態呈多角形，2周后細胞 基質礦化物逐漸出現，形成多層小結結構，培養3~4周以上，可觀察明顯鈣化結節，茜素紅 染色后呈深紅色結節沉積。
[0143] PDB-MSCs成軟骨誘導2~6d后，細胞團可脫壁漂浮，誘導過程中，細胞團形融合直 徑會有所增大，表面會變得光滑呈膠質樣。通過切片經Alcian blue染色II型膠原呈淡藍 色·
[0144] PDB-MSCs 細胞