膚，同時用鑷子將小鼠的皮膚 拉向兩側，暴露腹膜，換一套剪鑷剪開腹膜，即可看到脾臟。取出脾臟，放入裝有不完全1640 培養液的無菌培養皿中，小心剝離附著在脾臟表面的結締組織和脂肪等。再將脾臟置于另 一無菌培養皿中，加入1640不完全培養液，用鑷子在滅菌后的200目的銅網上對脾臟進行研 磨。研磨充分后，收集培養液并轉移至50mL離心管中，1000r/min離心15min，重懸細胞，計 數。
[0086] 2.5細胞融合
[0087] 將制備好的脾細胞和骨髓瘤細胞懸液，按脾細胞:SP2/0 ? 8:1~10:1之間的比例 混合，加于50mL離心管中，1000r/min離心15min，棄上清，輕彈離心管底，使細胞沉淀充分混 勻成糊狀，將離心管垂直置于盛有3 7 °C預熱的蒸餾水的燒杯中。吸取1 m L 3 7 °C預熱的融合 劑PEG3350，邊滴入細胞中邊輕輕搖動離心管，輕輕混勻，lmin內加完。靜置90s，在lmin內緩 慢滴入37°C預熱的不完全1640培養液lmL，邊滴邊輕輕轉動離心管，再重復一次，隨后在30s 內加入lmL不完全1640培養液，2min內加完7ml預熱的不完全1640，1000r/min離心10min離 心，棄上清。HAT選擇培養液將沉淀細胞懸起，混合均勻。將細胞懸液接種于已加有飼養細胞 的96孔細胞培養板中，每孔100yL，將培養板移至37°C 5 % C02培養箱中培養。
[0088] 2.6陽性雜交瘤細胞株的篩選
[0089] 每5-7天，采用半換液方式對融合后的細胞進行培養液的更換。待雜交瘤細胞長滿 孔底1/3~1/2時，取出細胞培養上清100uL，用建立的I-ELISA篩選方法對上清進行檢測，同 時用SP2/0上清作陰性對照，并設陽陰性鼠血清對照，以P/N 2 2.0為判定標準，對陽性孔進 行克隆。
[0090] 2.7雜交瘤細胞的克隆、凍存與復蘇
[0091] 將I-ELISA檢測為陽性孔的雜交瘤細胞集落懸起混勻，采用有限稀釋法，吸取一定 量細胞至無菌小青瓶中進行稀釋，稀釋至10mL含100個細胞，將稀釋好的細胞懸液以每孔 100yL加入到含有飼養細胞的96孔細胞培養板中培養。經過2~4次克隆，直至所有克隆化細 胞孔陽性率為100%時，即可確定已獲得分泌抗鵝CD4胞外區單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0092] 雜交瘤細胞株凍存時，將培養瓶中生長旺盛的雜交瘤細胞利用吸管進行反復吹 打、分散均勻后，置于10mL離心管中，1000r/min離心5min，棄掉培養液，收集細胞，用1.5mL 細胞凍存液將細胞重懸，加入到細胞凍存管中，做好標記后直接放入細胞程序凍存盒中，先 放于-70°C冰箱中，而后投入液氮容器中。
[0093]雜交瘤細胞復蘇時，從液氮容器中取出凍存管，迅速放入37°C水浴中，搖動使其在 lmin內迅速融化，而后500r/min離心5min，棄掉凍存液，用完全1640培養液將細胞沉淀懸 起，加入到事先盛有適量培養液的細胞培養瓶中，37 °C 5 % C02恒溫培養箱內培養，4h~12h 內觀察培養瓶中有部分細胞貼壁后，對其進行換液即可。
[0094] 2.8腹水的制備及純化
[0095] 高壓滅菌的液體石蠟，腹腔注射8-12周齡BALB/c小鼠，0.5mL/只，注射后7-10天注 射擴大培養的雜交瘤細胞。利用不完全1640培養液將生長旺盛的雜交瘤細胞吹下來， 1000r/min離心5min，棄去上清。用不完全1640培養液洗滌細胞一次，重懸細胞并計數，調整 細胞濃度為1~2 X 106個/mL，腹腔注射，0.5mL/只，注射后7~10天密切觀察小鼠的生長狀 態及腹水產生情況，當發現小鼠腹腔有流動性腹水時，及時收集腹水，并以l〇〇〇〇r/min離心 l〇min，棄去油脂和細胞沉淀，吸取澄清液體，分裝-70°C保存。
[0096] 腹水純化，將Protein G填料注入柱子中，輕柔的混合2次，用Binding Buffer A (Na2HP〇4 20Mm NaCl 0·15，ρΗ 7.0)平衡柱子2~3次；再加入Binding Buffer A稀釋300yL 腹水約2ml，4°C結合30min，期間每隔10min轉動一下柱子，使目的蛋白與填料充分結合;之 后用Elution Buffer B(critric acid 0.1mol，pH 2.0)洗脫目的蛋白，洗脫幾次，每次洗 脫后收集的流出液立即用等體積的lmol的Tris base(pH10.3)中和成pH8.0，最后經SDS PAGE檢測純化效果。
[0097] 3分泌抗鵝⑶4胞外區單克隆抗體雜交瘤細胞株的鑒定
[0098] 3.1雜交瘤細胞株染色體計數分析
[0099] 在生長旺盛的雜交瘤細胞中加入秋水仙素，使其終濃度為0.5yg/mL，繼續培養4~ 6h。吹下培養瓶中的細胞，將細胞懸液以1000r/min離心10min，棄上清液，加入37°C預熱的 5mL 0.075mol/L KC1低滲液，混懸細胞，37°C處理15~20min;加入新配制的固定液（甲醇與 冰醋酸3:1混合）lmL，邊滴邊混勾細胞懸液，1000r/min離心10min，棄上清液;再加入固定液 5ml將細胞沉淀重新懸浮并混勾，靜置30min后，1000r/min離心10min，棄上清液;重復操作 一次后小心吸出上清，保留少許固定液與細胞混勻后吸取1-2滴懸液加至載玻片上;干燥后 吉姆薩染色l〇min;選擇染色體分散良好、無重疊、失散的細胞進行鏡檢觀察并計數。
[0100] 3.2雜交瘤細胞株的穩定性分析
[0101 ]對雜交瘤細胞進行體外多次傳代，收集每次傳代的細胞上清，用建立的I-ELISA檢 測方法檢測上清〇D45〇nm值，分析雜交瘤細胞株分泌單克隆抗體的穩定性。
[0102] 4抗鵝⑶4胞外區單克隆抗體的特性鑒定
[0103] 4.1單克隆抗體亞類鑒定
[0104] 利用單抗Ig類/亞類鑒定用試劑盒進行鑒定，操作步驟參看試劑盒說明書進行。
[0105] 4.2單克隆抗體效價的測定
[0106] 根據建立好的I-ELISA檢測方法，取抗rGopET-30a-CD4ex單克隆抗體以1:1、1:2、 1:4等2倍倍比稀釋，測定OD4 5〇nm值，以P/N 2 2.0腹水的最大稀釋倍數作為其效價值。
[0107] 4.3單克隆抗體特異性的I-ELISA鑒定
[0108] 根據之前建立好的I-ELISA檢測方法，將純化后的重組蛋白rGopET-30a-CD4eX以 及鵝T淋巴細胞同時作為抗原包被酶標反應板，抗鵝⑶4胞外區重組蛋白rGopET-30a-⑶4ex 單克隆抗體作為一抗，并設有陽性、陰性對照，I-ELISA步驟同方法2.1。
[0109] 4.4單抗特異性的Western blot鑒定
[0110] 將純化后的重組蛋白rGopET-30a-CD4ex及鵝外周血淋巴細胞經SDS-PAGE電泳后 并轉印到NC膜上，以抗rGopET-30a-CD4ex單克隆抗體作為一抗，以HRP標記的山羊抗鼠 IgG 為二抗，PBST以1:2000稀釋，其余步驟同實施例1中方法2。
[0111] 4.5單抗特異性的IFA鑒定
[0112]將本發明發明人構建的真核質粒pCDNA3.1-CD4eX轉染雞胚成纖維細胞(CEF)。常 規方法制備CEF，鋪制48孔板，培養過夜，待細胞生長至60 %-70 %時備用。利用脂質體介導 的方法進行質粒的轉染，轉染的方法詳見轉染試劑LTX說明書。轉染后4h，棄去培養液，加入 含10%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養48h。之后用roS洗滌細胞3次，加入適量4%的多聚 甲醛固定30min，PBS洗3次；加入抗rGopET-30a-CD4ex單克隆抗體為一抗，以pCDNA3.1 ( + )空 質粒轉染孔做陰性對照，37°C作用2h，PBS洗3次；加入1: 50倍稀釋的FITC標記的山羊抗鼠 IgG抗體為二抗，37 °C避光作用lh，PBS洗3次，熒光顯微鏡下觀察熒光情況。
[0113] 4.6單抗的相對親和常數測定
[0114] 利用硫氰酸鹽洗脫法測定單抗的相對親和常數，根據之前建立好的I-ELISA檢測 方法，按純化的rGopET-30a-CD4ex蛋白最佳稀釋度包被過夜，100μL7孔，次日TOST洗滌3次； 抗rGopET-30a-CD4ex單克隆抗體的飽和濃度為一抗，lOOyL/孔，37 °C作用lh，PBST洗滌3次； 加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5臟〇1不同濃度的恥3^10(^17孔，室溫作用 15min JBST洗滌3次;加入1:5000倍稀釋的HRP標記的山羊抗鼠 IgG抗體為二抗，100μL7孔， 37°C作用lh，PBST洗滌3次;ΤΜΒ液100μL7孔，顯色5~10min，1Μ H2S〇4 50yL/孔終止反應，用 酶標測定儀測定〇D45_i值;結果判定，經硫氰酸鹽洗脫后每種抗體與抗原結合的OD45〇nm下 降至未經洗脫的〇D4 5Qnm的50 %時所對應的NaSCN濃度，即為該抗體的相對親和力常數，用 mol/L表不。
[0115] 結果：
[0116] 1抗鵝CD4胞外區單克隆抗體的制備
[0117] 1.1單