克隆抗體I-ELISA檢測方法的建立
[0118] 采用方陣法確定蛋白的最佳包被濃度及陽性血清的最佳稀釋倍數，根據棋盤I-ELISA陽性血清孔的OD45〇nm值接近1 · 0，陰性血清OD45〇nm值小于0 · 2，P/N>2 · 0，確定抗原抗 體最佳稀釋度。重組蛋白rGopET-30a-CD4eX最佳稀釋度為1:200，90ng/孔包被，陰陽性血清 最佳稀釋度為1: 1〇〇,如表1，I-ELISA試驗各影響因素條件的確定，如表2。
[0119] 全細胞ELISA反應程序為:每孔lOOyL檢測抗原（1 X 106個/孔），置于37°C恒溫培養 箱中孵育16~24h，TOST洗滌兩次，5 %脫脂乳-PBST 300yL/孔，37°C封閉2~4h，PBST洗滌兩 次;加入l〇〇yL雜交瘤細胞上清，37 °C孵育lh，PBST洗滌兩次;加入1:5000倍稀釋的山羊抗鼠 二抗，37°C孵育lh，PBST洗滌兩次后加入100μL孔TMB顯色液，避光顯色15min后，用1M H2S〇4 50yL/孔，終止反應。用酶標測定儀在波長450nm處測定每孔的光吸收(OD45〇nm)值。
[0120]表1抗原抗體最佳反應條件的確定
[0121]
[0123] 表2間接ELISA各個影響因素最佳反應條件的確定
[0124]
[0125] 1.2雜交瘤細胞株的建立
[0126] 免疫的BALB/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合后，經HAT培養液選擇性培養， 在第3天開始出現融合細胞。選擇經幾次特異性檢測并且0D 45Qnm值持續上升的5A9株雜交瘤 細胞株。經3~4次亞克隆，獲得能穩定分泌抗鵝CD4胞外區蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞 株，命名為5A9，將該雜交瘤細胞株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，保藏號是:CGMCC N0.11192。
[0127] 2分泌抗鵝⑶4胞外區單克隆抗體雜交瘤細胞株(CGMCC N0.11192)的鑒定
[0128] 2.1雜交瘤細胞株染色體計數分析
[0129] 骨髓瘤細胞染色體數目為55~65條，正常小鼠脾細胞的染色體數目為40條，本發 明得到5A9株雜交瘤細胞株的染色體數目為107條，在90~110條之間，SP2/0為55條左右在 正常染色體55~65條之間。該值大于脾細胞染色體數目的2倍，表明雜交瘤細胞確為脾細胞 與骨髓瘤細胞融合而成，如圖4。
[0130] 2.2雜交瘤細胞株分泌抗體穩定性分析
[0131] 將篩選的陽性雜交瘤細胞株擴大培養并傳 16代，收集每代的細胞上清，通過建立 的I-ELISA方法檢測細胞上清的OD45〇nm值，結果發現5A9分泌抗體的穩定性均較好，如圖5。
[0132] 3抗鵝⑶4胞外區單克隆抗體的特性鑒定
[0133] 3.1單克隆抗體亞類鑒定
[0134] 根據單抗Ig類/亞類鑒定用試劑盒進行鑒定，5A9單克隆抗體亞類為IgG2a。
[0135] 3.2單克隆抗體效價的測定
[0136] 根據建立好的I-ELISA方法，將抗rGopET-30a-CD4eX單抗5A9按2倍倍比稀釋測效 價，鼠陰陽性血清1:100稀釋作對照，5A9效價為1:2097152，如圖6。
[0137] 3.3單克隆抗體特異性的I-ELISA鑒定
[0138] 將重組蛋白rGopET-30a-CD4eX及鵝T淋巴細胞根據建好的I-ELISA方法包被，結果 發現5A9均能與重組蛋白及鵝外周血T淋巴細胞反應，如圖7。
[0139] 3.4單克隆抗體特異性的Western blot鑒定
[0140] Western blot結果顯示5A9能與重組蛋白rGopET-30a_CD4ex發生特異性反應，條 帶大小為54KDa，如圖8。且5A9可以與鵝外周血T淋巴細胞中的⑶4分子發生特異性反應，條 帶大小約為50KDa左右，比預測的天然的⑶4分子大小稍偏低，如圖9。
[0141] 3.5單抗特異性的IFA鑒定
[0142] 5A9單克隆抗體與轉染真核表達質粒pcDNA3.1-⑶4ex的雞胚成纖維細胞反應，產 生較強的綠色熒光信號，而pcDNA3.1( + )空質粒轉染的雞胚成纖維細胞與單抗并未產生熒 光信號，表明5A9單克隆抗體可特異性識別鵝CD4分子，如圖10。
[0143] 3.6單抗的相對親和常數測定
[0144] 利用硫氰酸鹽洗脫法測得5A9單克隆抗體的相對親和常數為3mol/L，具有中等強 度的親和力，如圖11。
[0145] 實施例3抗鵝CD4胞外區單克隆抗體在檢測禽類CD4+T淋巴細胞中的應用
[0146] 方法：
[0147] 1激光共聚焦檢測抗鵝CD4胞外區單克隆抗體交叉反應性
[0148] 常規方法制備鵝、鴨、雞外周血淋巴細胞，收集細胞后，PBS洗滌3次后，進行細胞計 數，每個瓶皿中加入細胞1 X 1 〇6個，分散均勻，利用4 %的多聚甲醛固定過夜;次日PBS洗滌3 次，利用0 · 5%Triton-X-100對細胞通透20min，PBS洗滌3次；加入經PBA(含1 %BSA的PBS緩 沖液）1:200倍稀釋的5A9單抗腹水，37 °C作用lh，PBS洗滌3次;加入1:200倍稀釋的FITC標記 的山羊抗鼠 IgG抗體為二抗，37°C避光作用45min，PBS洗滌3次;利用0.5mg/mL的DAPI進行細 胞核染色，37°C作用30min后，PBS洗滌3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號的產生情況。
[0149] 2流式細胞術分析抗鵝CD4胞外區單克隆抗體交叉反應性
[0150] 常規方法制備雞、鴨、鵝外周血淋巴細胞，收集細胞后，PBS洗滌3次，進行細胞計 數，每個EP管中加入細胞5 X 105個，1000r/min離心5min;分別加入經PBA(含1 %BSA的PBS緩 沖液)1:100倍稀釋的純化5A9單抗腹水，重懸細胞，4°C作用lh，PBS洗3次;加入1:100稀釋的 FITC標記的山羊抗鼠 IgG抗體為二抗，4°C避光作用45min，roS洗3次；用200yL PBS將細胞懸 起后，流式細胞儀FACS Aria(FACS Diva軟件)分析。
[0151] 結果：
[0152] 1激光共聚焦檢測抗鵝CD4胞外區單克隆抗體交叉反應性
[0153] 常規方法收集鵝、鴨、雞外周血淋巴細胞，將稀釋好的純化的5A9單克隆抗體腹水 適量加入細胞中，結果發現5A9單克隆抗體不僅鵝T淋巴細胞反應，而且與鴨、雞T淋巴細胞 也均有交叉反應性，如圖12,說明制備的單克隆抗體5A9可以用于檢測鵝、鴨以及雞的T淋巴 細胞。
[0154] 2流式細胞術檢測抗鵝CD4胞外區單克隆抗體交叉反應性
[0155] 經過流式細胞術分析健康狀態良好且未經免疫的成年鵝的CD4+T淋巴細胞所占淋 巴細胞的29.3 %，成年鴨的⑶4+T淋巴細胞所占淋巴細胞的28.3 %，成年雞的⑶4+T淋巴細胞 所占淋巴細胞的13.4%，分別與各自陰性對照相比5A9單克隆抗體檢測的T淋巴細胞出現了 明顯的陽性峰，說明5A9單抗均可以用于檢測鵝、鴨、雞外周血中的CD4+T淋巴細胞，如圖13。
【主權項】
1. 一種分泌抗鵝CD4胞外區單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于所述的雜交瘤細 胞株命名為5A9,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號是： CGMCC NO.11192。2. 由權利要求1所述的雜交瘤細胞株分泌產生的抗鵝CD4胞外區單克隆抗體。3. 權利要求2所述的抗鵝CD4胞外區單克隆抗體在制備檢測禽類外周血中CD4+T淋巴細 胞試劑中的應用。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述禽類包括鵝、鴨以及雞。
【專利摘要】本發明公開了抗鵝CD4胞外區單克隆抗體及其在檢測禽類外周血中CD4+T淋巴細胞中的應用。本發明利用攜帶鵝CD4胞外區的原核表達載體pET-30a-CD4ex，采用大腸桿菌RosettaTM(DE3)pLysS表達鵝CD4胞外區基因，得到重組蛋白rGopET-30a-CD4ex。以重組蛋白rGopET-30a-CD4ex為免疫原，免疫三次BALB/c小鼠，加強免疫后，經重組蛋白rGopET-30a-CD4ex篩選獲得1株穩定分泌抗鵝CD4胞外區單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為5A9，保藏號是：CGMCC？NO.11192。研究表明，由該雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體能與純化的重組鵝CD4胞外區蛋白rGopET-30a-CD4ex反應，同時也能夠與分離的鵝、鴨以及雞外周血淋巴細胞發生特異性反應。因此，本發明的提出為檢測禽類外周血中CD4+T淋巴細胞提供了一種新的、有效的技術手段。CGMCC NO.1119220150914
【IPC分類】C12N5/20, C07K16/28, G01N33/577, G01N33/569
【公開號】CN105647875
【申請號】
【發明人】王君偉, 曹春秋, 馬波, 張雪蓮, 高明春, 張文龍, 郝春雪, 崔嘉琦
【申請人】東北農業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月10日