[0041 ] SP2/0骨髓瘤細胞由本實驗室保存;感受態細胞RosettaTM(DE3)pLysS均由本實驗 室制備保存;重組質粒pET-30a-CD4ex(攜帶鵝CD4胞外區的原核表達載體）由本實驗室構建 并保存。
[0042] 1.3主要試劑
[0043] 1.3.1蛋白表達及純化試劑等
[0044] 蛋白標準Marker購自TaKaRa(大連）公司；IPTG購自北京索萊寶科技有限公司；DAB 顯色試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司;Ni-NTA親和層析純化試劑 盒、Protein G親和層析純化試劑盒購自GenScript(南京)生物技術有限公司公司；弗氏佐 劑(FA)、PEG和DAPI購自SIGMA公司；
[0045] 1.3.2抗體制劑
[0046] 兔抗鵝CD4多克隆抗體由本實驗室制備保存;辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠 IgG、羊抗兔IgG抗體均購自北京博奧森公司；異硫氰熒光素(FITC)標記的羊抗鼠 IgG購自北 京中杉金橋生物技術有限公司；小鼠單抗Ig類鑒定試劑盒(C060102)由洛陽佰奧通實驗材 料中心研制。
[0047] 1.3.3細胞類制劑
[0048]秋水仙素、人淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；HAT、HT選擇性培養 基及RPMI1640培養基購自GIBC0公司；Lipofectamine? LTX轉染試劑購自美國Invitrogen 公司。青霉素、鏈霉素購自哈爾濱三精制藥廠;胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。
[0049] 實施例1鵝CD4胞外區原核表達及抗原性鑒定
[0050] 方法：
[0051] 1、鵝⑶4胞外區原核表達
[0052] 1.1鵝⑶4胞外區基因的誘導表達
[0053] 將本實驗室構建好的重組質粒pET-30a_CD4ex按照常規方法轉化至RosettaTM (DE3)pLysS感受態細胞中。次日37°C培養至菌液0D6Q()的值達到0.4-0.6，按0.1 %加入IPTG 至終濃度為lmmol/L，37°C繼續培養4h。收獲誘導后菌液，4°C、5000r/min離心15min，棄上 清，0.01mol/L PH=7.2PBS重懸菌體。將重懸的菌液利用超聲波裂解細胞，4°C、5000r/min 離心15min，分別收集超聲上清及沉淀，經12 % SDS-PAGE分析重組蛋白的表達量及表達形 式，結果為包涵體表達，重組蛋白命名為rGopET-30a-CD4ex。
[0054] 1.2重組蛋白的純化
[0055]將獲得的包涵體蛋白分別與3mL Buffer B(100mM NaH2P〇4;10mM Tris-C1;8M Urea pH 8.0)混合加至已再生好的Ni-NTA柱中，4°C結合4h;收集流出液，然后分別用2ml含 lOmmol、5mmol、lOOmmol等濃度咪唑的Buffer B洗脫目的蛋白，每個梯度洗滌柱子5~6次， 收集洗滌液，而后進行SDS-PAGE分析。
[0056]將純化后的目的蛋白裝入透析袋中，放于含5%甘油的PBS透析液中于4°C透析，每 隔4~6h換液一次，除去尿素。透析后濃縮蛋白樣品并利用Bradford蛋白測定試劑盒測定純 化后蛋白濃度，其余加入20%甘油后，分裝保存于-20°C。
[0057] 2、鵝⑶4胞外區重組蛋白抗原性鑒定
[0058] 利用Western blot鑒定重組蛋白的抗原性，將純化的重組蛋白rGopET_30a-〇)4ex 經SDS-PAGE電泳后并轉印到NC膜上，55mA，40min，麗春紅染色發現目的條帶，PBST洗滌后， 5 %的脫脂乳，4 °C封閉過夜;次日PBST洗滌3次，5min/次，以本發明發明人制備的抗鵝⑶4胞 外區多克隆抗體作為一抗，37°C作用2h，PBST洗滌3次，5min/次;HRP標記的山羊抗鼠 IgG為 二抗，PBST以1:2000稀釋，37°C作用lh，PBST洗滌3次，5min/次;DAB避光顯色5~15min，觀察 目的條帶，蒸餾水終止。
[0059] 結果：
[0060] 1、鵝⑶4胞外區基因原核表達
[0061] 1.1鵝⑶4胞外區基因的誘導表達
[0062] 將陽性重組質粒pET-30a_CD4ex轉化至Rosetta?(DE3)pLysS感受態細胞中，經 IPTG誘導表達后，獲得重組蛋白，重組蛋白rGopET-30a-CD4ex大小約為54KDa，均與預期大 小相符，表達方式為包涵體表達，如圖1。
[0063] 1.2重組蛋白的純化
[0064] 重組蛋白rGopET-30a-CD4ex在變性條件下可被純化出來，且蛋白在含150mM咪唑 的8M尿素的溶液中被洗脫下來，如圖2。
[0065] 2、鵝⑶4胞外區重組蛋白抗原性鑒定
[0066] 重組蛋白rGopET-30a_CD4ex與已制備好的兔抗鵝⑶4胞外區多克隆抗體反應，可 以發現特異性條帶，說明重組蛋白具有良好的抗原性，如圖3。
[0067]實施例2抗鵝CD4胞外區單克隆抗體的制備 [0068]方法：
[0069] 1動物免疫
[0070]將純化的后的重組蛋白rGopET-30a-CD4eX作為免疫原，首免時與等體積的弗氏完 全佐劑乳化，其余免疫時與弗氏不完全佐劑乳化，經背部皮下多點注射6周齡BALB/C小鼠 (50ug/只），免疫間隔時間為2周，加強免疫3d后無菌取小鼠脾臟用于細胞融合，收集陰性、 陽性血清用于建立篩選陽性雜交瘤細胞株I -ELI SA。
[0071] 2單克隆抗體的制備
[0072] 2.1單克隆抗體I-ELISA檢測方法的建立
[0073]取健康的BALB/c小鼠，作為陰性對照鼠，與免疫小鼠在相同條件下飼養，融合前分 別將免疫小鼠和對照小鼠眼球采血，分離血清，-20 °C保存備用。
[0074]將純化的重組蛋白rGOpET-30a-CD4ex作為檢測原，利用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)將 檢測原做1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600和1:3200倍比稀釋，每孔100yL，加入微量反應 板，4 °C包被過夜。棄去板中液體，PBST洗滌3次，加封閉液(5 %脫脂乳)300yL/孔，37 °C封閉 2h。棄去板中液體，用TOST洗滌3次，將陽性、陰性血清用TOST分別做1:100、1: 200、1:400、1: 800倍比稀釋，lOOyL/孔，同時設空白對照，37 °C作用lh。棄去板中液體，PBST洗滌3次，用 TOST將HRP標記的羊抗鼠酶標二抗以1:5000稀釋，每孔100yL，37 °C作用lh。棄去板中液體， 用PBST洗滌3次，加入新配制的TMB顯色液100μL7孔，37°C顯色5-10min，1M H2S〇4 50yL/孔終 止反應。用酶標測定儀測定〇D45〇nm值。陽性血清孔的0D45_i值2 1 ·0,陰性血清孔的OD45〇nm 值< 0.2，P/N>2.0時的抗原、血清最大稀釋度為最佳工作濃度。
[0075]同時建立細胞I-ELISA方法作為輔助檢測方法：
[0076] 1)無菌采集鵝靜脈血，加入適量抗凝劑后，制備抗凝血，以1:1的比例與PBS混合；
[0077] 2)將上述混合液慢加入到等體積的淋巴細胞分離液界面上，2000rpm，離心15min。 吸取界面淋巴細胞，用PBS洗滌3次，2000rpm，離心5min;
[0078] 3)按Ludwig suter等改良方法，進行細胞ELISA，加入冰冷的0.1%戊二醛懸起細 胞，在4°C處理30min，PBS洗滌兩次，將細胞懸浮于1%834/0.1111〇1/1甘氨酸1^3中，室溫作用 60min，PBS洗滌兩次，用PBS將細胞重懸，調整細胞濃度為1 X 10 7/mL，-20 °C保存。
[0079] 4)通過棋盤滴定的方法確定抗原和抗體的工作濃度，并確定ELISA的反應程序。
[0080] 2.2飼養層細胞的制備
[0081] 在融合前一天，將未進行免疫的BALB/c小鼠眼球采血，分離血清作為陰性血清，頸 椎脫臼處死，75%酒精消毒5min后移入超凈工作臺內，固定于經紫外消毒的解剖板上，用滅 菌剪刀剪開皮膚，同時用鑷子鈍性剝離使腹膜充分暴露。用l〇ml-次性注射器吸取含20% 胎牛血清的HAT選擇培養液注入小鼠腹腔，全部注入后，再用注射器抽出腹腔內的培養液， 加入到準備好的HAT培養液中，調整細胞濃度在2 X105個/mL，將細胞懸液混勻后加入到96 孔細胞培養板中，1 〇〇μL7孔，置于37 °C 5 % C02培養箱中培養。
[0082] 2.3骨髓瘤細胞的準備
[0083]融合前2天對于生長狀態良好的骨髓瘤細胞擴大培養，融合當天，將處于生長旺盛 期的細胞收集至50ml離心管中，1000r/min離心15min，棄去上清，用不完全1640培養液洗滌 一次后，將細胞懸浮，計數，用于融合。
[0084] 2.4脾淋巴細胞的制備
[0085] 加強免疫后3天的BALB/c小鼠，眼球采血，頸椎脫臼處死，浸入75%酒精中消毒 5min，放入超凈工作臺中的解剖臺上。用滅菌剪刀剪開小鼠皮