團，很容易進行修飾和 改性。
[0027]所述的超支化聚乙烯亞胺結構如下所示，其具有高度對稱的幾何構造、很精確的 分子結構以及其分子量可控的優點。PEI具有很多的末端氨基，可被其他基團共價結合，從 而得到不同功能化的聚乙烯亞胺;其三維結構內部可形成空腔，可以包裹納米金顆粒等其 他無機顆粒，可以增加它的剛性。聚乙烯亞胺結構的多樣性決定了它在研究的各個方面具 有不同的功能。目前其制備方法是公知的，具體制法可參見文獻(Macromolecules，1986， 19,2466；Tomalia,D.A. ；Frechet,J.M.J.Dendrimers and Other Dendritic Polymers.New York,John ffiley&Sons Ltd,2001)〇
[0028]
[0029]所述包裹納米金顆粒的PEI復合物（PEI entrapped gold nanoparticles，Au TONPs)為水溶液。目前其制備方法是公知的，具體制法可參見文獻(Zhou，B.，et al.ACS Appl Mater Interfaces,2014.6(19):p.17190-9.)〇
[0030] 在實際應用中，將有效量的聚乙烯亞胺復合物作為添加劑加入到聚合酶鏈式反應 體系中進行PCR反應。所述有效量是指產生優化作用的有效用量范圍。針對Au PENPs復合物 納米金顆粒與PEI摩爾比不同，聚合酶鏈式反應體系不同，產生優化作用的所需添加的該復 合物有效用量范圍是不同的。本領域技術人員可以方便地通過下述方法來實驗得出有效用 量:針對不同聚合酶鏈式反應體系，不同Au/PEI摩爾比的聚乙烯亞胺復合物產生優化作用 的有效用量范圍通過以下方法進行確定：通過對該種Au PENPs復合物進行梯度稀釋或濃 縮，以濃度梯度方式加入到該聚合酶鏈式反應體系中，以實際擴增達到優化目的的范圍為 所需該Au PENPs復合物的有效用量范圍。
[0031] 所述的PCR體系的一般組成成份見于各種常用分子生物學工具書或各種商業聚合 酶說明書。以Takara公司rTaq酶為例，一個PCR擴增反應的組成為：
[0032]
[0033]
[0034]所述的PCR反應的一般過程為：
[0035] (1)制備PCR反應體系，包括合適用量的DNA聚合酶、引物、模板、dNTP、PCR緩沖液 等；
[0036] (2)在PCR儀上以設定的程序進行PCR反應；
[0037] (3)擴增完成后的產物進行檢測。
[0038]當該PCR反應需要優化時，在制備PCR反應體系過程中加入起優化作用的添加劑， 在本發明中，添加劑為有效量的包裹納米金顆粒的聚乙烯亞胺復合物。
[0039] PCR產物檢測可以采用多種檢測方法，如對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳 檢測，或對擴增后樣品進行毛細管電泳檢測，或在實時定量PCR儀上進行實時定量檢測PCR 的實時擴增過程。
[0040]本發明與已有方法相比，具有優化擴增的效果顯著，添加劑Au PENPs復合物成本 低廉，易于保存，應用廣泛的優點。擴增產物的特異性得到顯著提高，在某些反應中產物的 產量也得到明顯的提高。和之前申請的相關專利相比，如納米金顆粒（專利號 CN200410099186.7)和樹狀大分子（專利申請號CN200810041931.0)，本發明中Au PENPs復 合物的水溶液可以長期保存在4°C和_20°C，并且沒有失去活性和形成聚集的擔心，另外由 于分子內部包裹了納米金顆粒，使得表面有效基團大大增加，用量更省。聚乙烯亞胺價格 (一般低于0.005元/反應)也比單鏈結合蛋白（0.48元/反應)便宜很多，試劑均一度好，易于 保存和準確加樣。本發明優化后的PCR反應體系不僅適用于控溫精確的PCR儀，也適用于控 溫性能較差的PCR儀。本發明發展的向PCR反應中添加包裹納米金顆粒的聚乙烯亞胺復合物 的方法可以應用于各種PCR擴增、聚合酶延伸以及基于PCR方法基礎的其他生化方法，尤其 適用于一些較難擴增類型的PCR方法諸如：一次擴增不成功而需要再擴增、高GC含量的擴 增、人類基因組GAP的擴增、高背景低拷貝模板的擴增、古生物DNA擴增等等。本發明也適用 于實時定量PCR反應。本發明對基因檢測與克隆、遺傳分析、臨床診斷、基因芯片以及新材料 等領域有著潛在而巨大的應用價值。
[0041 ] 有益效果
[0042] (1)本發明的方法優化擴增的效果顯著，添加劑成本低廉，易于保存，應用廣泛； [0043] (2)本發明對基因檢測與克隆、遺傳分析、臨床診斷、基因芯片以及新材料等領域 有著潛在而巨大的應用價值。
【附圖說明】
[0044]圖1為實施例1中PCR體系進行第一次擴增結果圖；
[0045]圖2為實施例1中添加 PEI對非特異性擴增嚴重的再擴增PCR反應進行優化的效果 圖；
[0046] 圖3為實施例2中添加 Au/PEI摩爾比為100:1的{(Au)1Q()-PEI-mPEG24}對非特異性擴 增嚴重的再擴增PCR反應進行優化的效果圖；
[0047] 圖4為實施例3中添加 Au/PEI摩爾比為200:1的KAu)2(x)-PEI-mPEG24}對非特異性擴 增嚴重的再擴增PCR反應進行優化的效果圖；
[0048] 圖5為實施例4中添加 Au/PEI摩爾比為300:1的KAu)3(x)-PEI-mPEG24}對非特異性擴 增嚴重的再擴增PCR反應進行優化的效果圖；
[0049] 圖6為實施例5中添加末端氨基乙酰化的Au/PEI摩爾比為200:1的{(Au)2Q()-PEI-Ac-mPEG 24}對非特異性擴增嚴重的再擴增PCR反應進行優化的效果圖；
[0050]圖7為實施例6中添加 PEI對高GC含量PCR反應進行優化的效果圖；
[0051 ] 圖8為實施例7中添加 Au/PEI摩爾比為100 :1的{(Au)1QQ-PEI-mPEG24}對高GC含量 PCR反應進行優化的效果圖；
[0052] 圖9為實施例8中添加 Au/PEI摩爾比為200 :1的{(Au)2Q()-PEI-mPEG24}對高GC含量 PCR反應進行優化的效果圖；
[0053] 圖10為實施例9中添加 Au/PEI摩爾比為300:1的{(Au)3Q()-PEI-mPEG24}對高GC含量 PCR反應進行優化的效果圖；
[0054] 圖 11為實施例 10 中添加 PEI(a)，{(Au)io〇-PEI-mPEG24}(b)，{(Au)2〇〇-PEI-mPEG24} (c)and{(Au) 3(x)-PEI-mPEG24}(d)對縮短PCR反應時間的PCR反應進行優化的效果圖；其中d圖 中的第四列和第五列是縮短了變性時間至25s的效果圖。
【具體實施方式】
[0055] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0056] 實施例1
[0057]添加單純PEI對非特異性擴增嚴重的再擴增PCR反應進行優化。
[0058] 在進行一些目標模板很少或樣品極其稀少的擴增實驗時，常常會發現一次擴增無 法得到目標條帶，這時就需要進行再擴增，即用一次擴增得到的產物作為模板繼續進行第 二次的擴增，提高產物中目標條帶的產量。但是用再擴增提高產量的同時也會形成一些非 特異性的擴增。
[0059] 針對這種形成非特異性擴增的PCR再擴增情況，通過向PCR再擴增體系中添加有效 量的樹枝狀聚合物來實現對其的優化。
[0060] 具體而言，包括下列步驟：
[0061 ] 1、制備PCR體系進行第一次擴增。
[0062] 體系組成如下表：
[0063]
[0064] 其中，模板為lambdaDNA，稀釋為108copy/yL，rTaq酶購自Takara公司，擴增片段長 度為283bp。引物序列為p 1:5 ' -GGCTTCGGTCCCTTCTGT-3 ' ； p2: 5 ' -CACCACCTGTTCAAACTCTGC-3，。
[0065]擴增條件為：95 °C預熱3分鐘；30個循環，每個循環包括:94 °C變性20秒，55 °C退火 30分鐘，72°C延伸30秒;最后72°C延伸5min。
[0066]對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現明亮的單一目標條帶，說明第 一次擴增結果良好，如圖1所示。
[0067] 2、將購買的PEI配成濃度為1μg/μL，分子量為25000,使用前需要在超凈臺中稀釋 1〇{首后備用。
[0068] 3、向以上PCR體系中加入不同體積的PEI，使得每25yL PCR反應體系中PEI的濃度 分別為〇，〇. 4，0.45，0.47，0.49，0.52mg/L，同時做不加優化劑的相應對照組。
[0069] 4、利用PCR技術對模板分子進行擴增，擴增程序與第一次擴增條件相同。
[0070] 5、對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢查擴增條帶，與對照體系進行 比較。
[0071] 擴增結果如圖2所示。從左至右依次為M:分子量標