加入10，12，14，16mg/L PEI的高GC體系;6為不加入模板的空白對照。可以看出加入PEI 為12~14mg//L的體系PCR擴增得到單一目標帶，而相應的未加入PEI的常規PCR體系擴增結 果顯示嚴重后續拖尾，表明非特異性擴增嚴重。該PCR擴增結果顯示了本發明對于PCR擴增 有顯著的優化效果，特別是可以提高擴增特異性。
[0101] 實施例7
[0102] 添加 Au/PEI摩爾比為100:1的{(Au)1Q()-PEI-mPEG24}對高GC含量PCR反應進行優化。 [0103]反應體系和具體過程同實施例6,所不同的是添加的優化劑為自制的{(Au)100-PEI-mPEG 24}，濃度為1. Oyg/yL，分子量為92700，使用前需要在超凈臺中稀釋10倍后備用。 [0104] 擴增結果如圖8所示。從左至右依次為M:分子量標記(Takara公司DL2000,分別為 2000bp，lOOObp，750bp，500bp，250bp，100bp); 1為未加入{(Au)iQ〇-PEI-mPEG24}水溶液的高 GC體系；2，3，4，5，6分別為加入6，8，10，12，14mg/L{ (Au)1QQ-PEI-mPEG24}的高 GC體系；7為不 加入模板的空白對照。可以看出加入{(Au) 1QQ-PEI -mPEG24}為8~10mg/L的體系，PCR擴增結 果中非特異性擴增明顯減少，特別是{(Auhoo-PEI-mPEGW加入量為8mg/L時擴增得到單一 目標帶，而相應的未加入KAu) 1(x)-PEI-mPEG24}的常規PCR體系擴增結果顯示嚴重后續拖尾， 表明非特異性擴增嚴重。該PCR擴增結果顯示了本發明對于PCR擴增有顯著的優化效果，特 別是可以提高擴增特異性。
[0105] 實施例8
[0106] 添加 Au/PEI摩爾比為200:1的KAu)2(x)-PEI-mPEG24}對高GC含量PCR反應進行優化。 [0107]反應體系和具體過程同實施例6,所不同的是添加的優化劑為自制的{(Au) 200-PEI-mPEG24}，濃度為1. Oyg/yL，分子量為112400，使用前需要在超凈臺中稀釋10倍后備用。
[0108] 擴增結果如圖9所示。從左至右依次為M:分子量標記(Takara公司DL2000,分別為 2000bp，lOOObp，750bp，500bp，250bp，100bp); 1為未加入{(Au)2Q〇-PEI-mPEG24}水溶液的高 GC 體系；2，3，4，5，6分別為加入5，5 · 6，6，8，10mg/L{ (Au)2Q()-PEI-mPEG24}的高GC 體系；7為不 加入模板的空白對照。可以看出加入{(Au )2QQ-PEI-mPEG24}為5.6~8mg/L的體系，PCR擴增結 果中非特異性擴增明顯減少，特別是{(Au) 2Q()-PEI-mPEG24}加入量為6mg/L時擴增得到單一 目標帶，而相應的未加入KAu) 2m-PEI-mPEG24}的常規PCR體系擴增結果顯示嚴重后續拖尾， 表明非特異性擴增嚴重。該PCR擴增結果顯示了本發明對于PCR擴增有顯著的優化效果，特 別是可以提高擴增特異性。
[0109] 實施例9
[0110] 添加 Au/PEI摩爾比為300:1的KAu)3()()-PEI-mPEG24}對高GC含量PCR反應進行優化。
[0111] 反應體系和具體過程同實施例6,所不同的是添加的優化劑為自制的KAu) 300-PEI-mPEG24}，濃度為l.Oyg/yL，分子量為132100,使用前需要在超凈臺中稀釋10倍后備用。
[0112] 擴增結果如圖10所示。從左至右依次為M:分子量標記(Takara公司DL2000,分別為 2000bp，lOOObp，750bp，500bp，250bp，100bp); 1為未加入{(Au)3QQ-PEI-mPEG24}水溶液的高 GC體系;2，3，4，5分別為加入4，5 · 6，6，8mg/L{ (Au)3m-PEI-mPEG24}的高GC體系;6為不加入模 板的空白對照。可以看出加入{(Au) 3m-PEI-mPEG24}為4~6mg/L的體系，PCR擴增得到明亮的 單一目標帶，而相應的未加入{(Au) 3Q()-PEI-mPEG24}的常規PCR體系擴增結果顯示嚴重后續 拖尾，表明非特異性擴增嚴重。該PCR擴增結果顯示了本發明對于PCR擴增有顯著的優化效 果，特別是可以提高擴增特異性。
[0113] 實施例1〇
[0114] 添加 PEI(a)，{(Au)l。。-PEI-mPEG24}(b)，{(Au)2。。-PEI-mPEG24}(c)and{(Au)3oo-PEI-mPEG 24} (d)對縮短PCR總時間和只縮短變性時間至25s的改進高GC含量PCR反應進行優 化。
[0115] 反應體系和具體過程大致同實施例6,只是（l)PCR擴增條件改變為:94°C預變性2 分鐘;35個循環，每個循環包括:94°C變性45s，64.2°C退火90s，72°C延伸60s;最后72 °C延伸 5分鐘；（2)PCR擴增條件實施例6,唯一的不同是變性時間縮短為25s(見圖10中d圖的第四列 和第五列）。另外就是添加的優化劑為自制的PEI(a)，{(Au) 1()()-PEI-mPEG24}(b)，{(Au)200-PEI-mPEG 24} (c)and{(Au)300-PEI-mPEG24} (d)，濃度均為 1 ·0yg/yL，使用前需要在超凈臺中 稀釋10彳首后備用。
[0116] 擴增結果如圖11所示。從左至右依次為M:分子量標記(Takara公司DL2000,分別為 2000bp，lOOObp，750bp，500bp，250bp，100bp); 1為未加入材料水溶液的擴增體系；最后一列 為不加入模板的空白對照，（b)圖中2，3，4分別為加入3.2，4，4.4mg/L{ (Auhoo-PEI-mPEGW 的高GC體系，（c)圖中2，3，4分別為加入2.4，3.2，3.6mg/L{ (Au)2Q()-PEI-mPEG24}的高GC體系， (d)圖中2,3,4,5分別為加入2,2·8,0,4mg/L{(Au) 3(x)-PEI-mPEG24}的高GC體系。可以看出加 入PEI時沒有效果(a)，而當加入3 · 2~4mg/L的{(Au)1QQ-PEI-mPEG24} (b)，2 · 4~3 · 2π^/1的 {(Au) 2QQ-PEI -mPEG24} (c)或者 2 ~2 · 8mg/L 的{(Au) 3QQ-PEI -mPEG24} (d)時，PCR擴增由無目標 條帶變成了有單一目標帶，另外加入4mg/L的{(Au)3Q()-PEI-mPEG 24}時，PCR產品由有非特異 性條帶(d中第四列)變成了單一條帶(d中第五列）。該PCR擴增結果顯示了本發明對于PCR擴 增有顯著的優化效果，特別是可以提高擴增特異性和效率。
【主權項】
1. 一種聚合酶鏈式反應的優化方法，其特征在于，有效用量的聚乙烯亞胺PEI或者包裹 納米金顆粒的PEI復合材料作為添加劑加入到聚合酶鏈式反應PCR中；其中，有效用量的確 定方法包括:通過對PEI或者包裹納米金顆粒的PEI復合材料進行梯度稀釋或濃縮，以濃度 梯度方式加入到該聚合酶鏈式反應體系中，以實際擴增達到優化目的的范圍為PEI或者包 裹納米金顆粒的PEI復合材料的有效用量。2. 根據權利要求1所述的一種聚合酶鏈式反應的優化方法，其特征在于，所述包裹納米 金顆粒的PEI復合材料為Au/PEI摩爾比為100:1，200:1，300:1的超支化的聚乙烯亞胺樹枝 狀大分子。3. 根據權利要求1或2所述的一種聚合酶鏈式反應的優化方法，其特征在于，所述PEI的 末端基團為氨基、乙酰基、羧酸基或羥基。4. 根據權利要求1所述的一種聚合酶鏈式反應的優化方法，其特征在于，所述聚合酶鏈 式反應體系為易產生非特異性擴增的體系、GC含量高的擴增體系、模板數為低拷貝的體系、 復雜基因背景體系和人基因組Apolipoprotein E基因的高GC含量擴增體系中的至少一種。5. 根據權利要求1所述的一種聚合酶鏈式反應的優化方法，其特征在于，所述PCR反應 的步驟包括:制備PCR反應體系;在PCR儀上以設定的程序進行PCR反應;對擴增完成后的產 物進行檢測。6. 根據權利要求5所述的一種聚合酶鏈式反應的優化方法，其特征在于，所述制備PCR 反應體系包括DNA聚合酶、引物、模板、dNTP、PCR緩沖液;所述對擴增完成后的產物進行檢測 包括:對擴增后的DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，或對擴增后樣品進行毛細管電泳檢 測，或實時定量檢測PCR的實時擴增過程。
【專利摘要】本發明涉及一種聚合酶鏈式反應的優化方法，所述優化方法中有效用量的聚乙烯亞胺PEI或者包裹納米金顆粒的PEI復合材料作為添加劑加入到聚合酶鏈式反應PCR中。本發明具有優化擴增的效果顯著，添加劑成本低廉，易于保存，應用廣泛的優點。擴增產物的特異性得到顯著提高，在某些反應中產物的產量也得到明顯的提高；在基因檢測與克隆、遺傳分析、臨床診斷、基因芯片等領域有著潛在而巨大的應用價值。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105647908
【申請號】
【發明人】曹雪雁, 李愛軍, 史向陽
【申請人】東華大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月22日