12、14、16、18、20時所需要的病毒液體積。配制不同藥物濃度的司他夫定，并將上述所需 病毒液加至不同濃度的藥物中。將配制好的藥物與病毒混合液，加入到96孔huh7.5細胞中。 感染60小時后，檢測每孔細胞熒光素酶基因表達活性。結果顯示，Μ0Ι為10時，藥物濃度和熒 光素酶的活性相關性最佳。結果如圖8中的B圖所示。
[0054] (3.5.3)HIV藥物司他夫定敏感性與病毒感染時間相關實驗 鋪板96孔板huh7.5細胞，分4組，每組20000個/孔，當細胞匯合度達到80 %時，按照每孔 細胞數目計算M0I = 10時所需要的病毒液體積。配制不同藥物濃度的司他夫定，并將上述所 需病毒液加至不同濃度的藥物中。將配制好的藥物與病毒混合液，加入到96孔huh7.5細胞 中。分別于病毒感染36、48、60、72小時后，檢測每孔細胞熒光素酶活性。結果顯示，感染時間 為60小時時，藥物濃度和熒光素酶的活性相關性最佳。結果如圖8中的C圖所示。
[0055] (3.5.4)十二種抗病毒藥物用于表型耐藥檢測的可重復性 通過測定12種抗病毒藥物IC50的藥物濃度來判斷表型耐藥檢測的穩定性和可重復性。 根據上述3個實驗，確定了用于表型耐藥檢測時的細胞數目、Μ0Ι以及病毒感染時間。鋪96孔 板，當細胞匯合度達到80%時，按照每孔細胞數目計算MOI = 10時所需要的病毒液體積。與 此同時，用DMEM完全培養液配制不同藥物濃度的HIV藥物，將配置好的藥物與病毒混合液， 加入到96孔huh7.5細胞中。感染60小時后，檢測每孔細胞熒光素酶活性。結果顯示，除了2種 藥物(利匹韋林和依曲韋林)大部分藥物都顯示較高的重復性。結果如表7所示，其中，IC50， 能夠使ZsGreen陽性細胞減少50 %的藥物濃度;SD，標準差;CV，變異系數。
[0056]表7十種藥物用于表型耐藥檢測的可重復性
(3.5.5)病人體內HIV-1毒株的表型耐藥分析 8名患者的HIV-1樣本用本發明中帶有雙報告基因的重組慢病毒系統進行表型耐藥分 析。野生型的慢病毒作為對照。病毒抑制率（％ ) = ( 1-藥物處理組的熒光素酶RLU/對照組的 熒光素酶RLU)X100%。用非線性回歸分析每個HIV-1毒株的ICSOAIV-l毒株對每種抑制劑 的表型耐藥程度用倍數變化(FC)來表示，即測試株的IC50/野生株的IC50。校正的用于表型 耐藥的分類標準:FC〈3為敏感，FC = 3-6為低度耐藥，FC = 6.01-10為中度耐藥，FC>10為高度 耐藥[6,22,23]。表4呈現了6種6冊1'18(0丨(1&11〇8；[116,3七&￥11(1;[116,2丨(10￥11(1;[116,2&1(3；^&13；[116， Emtricitabine，Abacavir Sulfate)，4NNRTIs(Nevirapine，Etravirine，Dapivirine， Rilpivirine)及2種PIs(Nelfinavir and Lopinavir)的表型耐藥情況。Zalcitabine(DDC) 和Dapivirine(DPV)兩種藥物在現有數據庫中無基因型耐藥情況分析。對10種藥物的表型 耐藥與基因耐藥結果進行分析，表明，大部分一致(表8)。例如，HIV-1毒株0022表型耐藥分 析對DDI和D4T兩種藥物敏感，但是基因型耐藥分析顯示為中度或高度耐藥，毒株0312對ETR 表型耐藥分析為高度耐藥，但基因型分析為低度耐藥。
[0057] 表8HIV-1毒株的基因型和表型耐藥分析比較
[0058]以上所述實施例僅表達了本發明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能 因此而理解為對本發明專利范圍的限制，但凡采用等同替換或等效變換的形式所獲得的技 術方案，均應落在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測中的應用，該重組慢病毒是包裝質粒、包膜質粒 和轉移質粒共轉染293FT細胞或293T細胞后得到的包裝體;其中，所述包裝質粒為psPAX2m-pol質粒;所述轉移質粒為pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen質粒。2. 根據權利要求1所述的重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測中的應用，其特征在于，所述 轉移質粒結構如圖1所示。3. 根據權利要求1所述的重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測中的應用，其特征在于，所述 轉移質粒的構建方法，包括以下步驟:使用BamH I和Κρη I雙酶切pMD2.G質粒，回收酶切產 物，收取119bp CMV片段;將pHAGE-EFla-IRES-ZsGreen質粒用BamH I和Κρη I進行雙酶切， 回收4736bp pHAGE-IRES-ZsGreen片段；將回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用Τ4 DNA 連接酶進行連接，連接成功后，提取的質粒命名為pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen質粒;使用Ncol 和Xbal雙酶切PGL3_Promoter Vector，回收 1906 bp Luciferase片段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen質粒用Ncol和Xbal雙酶切，回收4855bp的片段，將該片段和Luciferase片段用T4 DNA連接酶進行連接;連接成功后，提取的質粒即為pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen。4. 根據權利要求1所述的重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測中的應用，其特征在于，所述 psPAX2m_pol質粒結構如圖3所示。5. 根據權利要求1所述的重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測中的應用，其特征在于，所述 psPAX2m-pol質粒序列如SEQIDNo·6所示。6. 根據權利要求1所述的重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測中的應用，其特征在于，所述 psPAX2m-po 1質粒的構建方法，包括以下步驟： psPAX2載體重建:利用長引物法突變psPAX2載體的酶切位點Agel，獲得psPAX2-l載體； 利用定點突變試劑盒突變PSPAX2-1載體的酶切位點Apal，獲得psPAX2-2載體;Dpnl酶切 psPAX2-2載體，酶切產物轉化XL 10-G0LD感受態細胞，質粒提取，Apal酶切該質粒，挑取酶 切產物鑒定測序，獲得psPAX2m載體，其序列如SEQIDN 0.4所示； psPAX2m-pol質粒構建：利用PCR擴增pol片段，其序列如SEQIDNo.5所示；用ApaI和 Agel酶切擴增后的pol片段回收并插入psPAX2m載體，得到psPAX2m-p〇l質粒，其序列如SEQ ID No .6所示。7. 根據權利要求6所述的重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測中的應用，其特征在于，所述 psPAX2-l載體的序列如SEQIDNo.2所示。8. 根據權利要求6所述的重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測中的應用，其特征在于，所述 psPAX2-2載體的序列如SEQIDNo.3所示。9. 根據權利要求6所述的重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測中的應用，其特征在于，所述 psPAX2m載體的序列如SEQIDNo.4所示。10. 根據權利要求6所述的重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測中的應用，其特征在于，所述 長引物法突變psPAX2載體所用的引物為Age I-F和Age I-R，其中， AgeI-F：CGAAGAGCTC ATCAGAACAG TCAGACTCAT CAAGCTTCTC TATC； AgeI-R：CTGCTAGCTA TAGTTCTAGA GGTATCGGTT GTTTCGAGCT TATAG； 模板為 psPAX2，PCR 條件:94°C 預變性 4min，94°C 變性 2〇8、55°(：退火2〇8、72°(：延伸11^11， 循環35次，最后72°C延伸5min; 所述利用定點突變試劑盒突變PSPAX2-1載體所用的引物為M-Apal-F和M-Apal-R;其 中， M-ApaI-F：GCC TTG AGG GGC CTC CGG GGA CGG CCC TTT GTG CGG GG M-ApaI-R：CCC CGC ACA AAG GGG CCG TCC CGG AGC CCC CTC AAG GC； 模板為psPAX2-l，PCR條件：95°C預變性2 min，95°C變性30 sec，55°C退火lmin，68°C延 伸lOmin，循環18次。
【專利摘要】本發明公開了一種重組慢病毒在HIV表型耐藥檢測中的應用，該重組慢病毒是包裝質粒、包膜質粒和轉移質粒共轉染293FT細胞或293T細胞后得到的包裝體；其中，所述包裝質粒為psPAX2m-pol質粒；所述轉移質粒為pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen質粒。該重組慢病毒安全高效毒副作用小成本低，將其應用于HIV表型耐藥檢測中，能為臨床上合理有效地選用抗HIV藥物提供重要參考依據。該轉移質粒報告基因Luciferase與ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV啟動子控制報告基因Luciferase與ZsGreen的表達，使得HIV-1抑制劑的抗病毒效果能夠簡易地通過在倒置熒光顯微鏡下觀察到或通過測定熒光素酶活性而獲得，將pol區導入后，多種細胞用具有此轉移質粒的重組慢病毒均可進行耐藥性檢測，通用性強。
【IPC分類】C12Q1/66, C12N15/867, C12Q1/02, C12N7/01
【公開號】CN105648037
【申請號】
【發明人】黎誠耀, 翁云層, 張玲, 李金峰
【申請人】南方醫科大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月30日